李慧星，韓朝淇，姚涵譯，許 彬1， *，羅建成

（1.南陽理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；3.南陽理工學(xué)院 張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 473004）

濃香型是白酒基本香型之一。固態(tài)濃香型白酒用單糧或多糧作為發(fā)酵原料，以大曲作為糖化發(fā)酵劑，原料經(jīng)長期發(fā)酵后形成酒醅。酒醅中的揮發(fā)性成分在蒸餾過程中被提取、濃縮，進(jìn)入原酒，因此原酒中的香氣物質(zhì)的種類和含量主要取決于酒醅中揮發(fā)性成分的種類和含量[1-3]。

酒醅中揮發(fā)性成分主要包括酯類、醇類、酮類、醛類、酸類、醚類、酚類、苯環(huán)類、烯烴類化合物[4-5]。出窖酒醅的揮發(fā)性成分會受到多種因素的影響。酒醅和窖泥中的微生物會影響出窖酒醅揮發(fā)性成分，如譚壹[6]研究發(fā)現(xiàn)Geortrichum silvicola和庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）與持續(xù)發(fā)酵段乙酸乙酯、己酸乙酯及丁酸乙酯的增加有關(guān)；應(yīng)靜[7]研究發(fā)現(xiàn)甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）可能參與丁酸乙酯生成；趙東等[8]研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中的微生物與香氣物質(zhì)不斷地與糟醅發(fā)生著相互交換。釀造用糧食會影響出窖酒醅的揮發(fā)性成分，如劉睿[9]研究發(fā)現(xiàn)，原料中的原花青素會對小曲白酒中異丁醇、異戊醇、乙酸、乙醛、糠醛、乙酸乙酯和乳酸乙酯產(chǎn)生影響；閆涵等[10]發(fā)現(xiàn)多糧酒醅比單糧酒醅發(fā)酵生成更多的乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。釀造工藝條件會影響出窖酒醅的揮發(fā)性成分，如李杰等[11]的研究表明低溫入窖有利于酵母菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)酒，有利于酯類物質(zhì)的生成。出窖酒醅的揮發(fā)性成分還受到窖池空間分布的影響，如雷學(xué)俊等[4]研究發(fā)現(xiàn)酯類和酸類在窖池中的含量分布規(guī)律為下層＞中層≥上層，同層糟醅距離窖壁越近含量越高且呈擴(kuò)散遞減趨勢。

入窖酒醅成分也可能對出窖酒醅的揮發(fā)性成分產(chǎn)生影響。濃香型白酒多采用續(xù)糟混蒸工藝[4，12-13]，入窖酒醅中除了含有糧食、大曲引入的揮發(fā)性成分外[10，14-15]，還含有酒醅蒸餾后的殘留揮發(fā)性成分[13，16]，這些成分都將參與下一輪發(fā)酵。有報(bào)道表明，入窖酒醅酸度對出窖酒醅香氣有顯著影響[17]，但入窖酒醅的揮發(fā)性成分對出窖酒醅的影響未見報(bào)道。本研究采用頂空-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）對不同來源的出窖和入窖酒醅揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，比較不同來源的出窖酒醅之間、不同來源的入窖酒醅之間在揮發(fā)性成分上的差異，分析入窖酒醅揮發(fā)性成分對出窖酒醅揮發(fā)性成分可能產(chǎn)生的影響，為控制出窖酒醅質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同種香型白酒酒醅樣品：兩個(gè)白酒生產(chǎn)企業(yè)提供，兩個(gè)企業(yè)均采用高粱、玉米、小麥和糯米為釀造原料，以大曲為釀造用曲，采用續(xù)糟發(fā)酵工藝。出窖酒醅取樣時(shí)，每個(gè)來源選取2個(gè)發(fā)酵期為60 d的窖池，每個(gè)窖池分別取窖池上、中、下層中心處的酒醅，共6個(gè)樣品。入窖酒醅取樣時(shí)，每個(gè)來源選取兩個(gè)拌料后料堆，每個(gè)料堆分別取堆頂、中心、堆底處的酒醅，共6個(gè)樣品。所有樣品用封口袋密封保存后于-20 ℃冷凍保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

Scion SQ-451氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、SHS-40 SL頂空進(jìn)樣系統(tǒng)、BR-swax毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：美國布魯克道爾頓公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

所有樣品解凍后，將同一來源的6個(gè)出窖/入窖酒醅取等量（10.0 g）混合，然后精確稱取混勻后的酒醅5.000 0 g放入20 mL頂空瓶中，加入6 mL蒸餾水、2.2 g NaCl，混勻，壓緊瓶蓋。來自A企業(yè)的出窖/入窖酒醅分別編號為S_1和S_2，來自B企業(yè)的出窖/入窖酒醅分別編號為S_3和S_4。

1.3.2 頂空實(shí)驗(yàn)條件

樣品瓶加熱溫度：50 ℃；閥和定量環(huán)加熱溫度：120 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；樣品瓶加熱時(shí)間：45 min；加熱方式：振蕩加熱；進(jìn)樣體積：0.25 mL，進(jìn)樣時(shí)間：1 min。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：BR-swax毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度35 ℃保持4 min，以3 ℃/min升至150 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至220 ℃保持20 min；載氣為氦氣（He），流速2.0 mL/min，分流比5∶1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～350 m/z；數(shù)據(jù)采集掃描模式：全掃描模式；溶劑延遲時(shí)間0.5 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算總離子流色譜圖中各峰面積的百分比，作為揮發(fā)性成分的相對百分含量[18-19]。利用軟件R3.6.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化。以樣本各揮發(fā)性成分的相對百分含量為指標(biāo)計(jì)算樣本揮發(fā)性成分多樣性距離矩陣、以樣本中各類化合物相對百分含量為指標(biāo)計(jì)算樣本揮發(fā)性成分類別距離矩陣和香氣成分類別距離矩陣，利用vegan包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）[22-23]，展示樣本間揮發(fā)性成分多樣性的差異[20-21]、樣本間揮發(fā)性成分類別差異以及樣本間香氣成分類別差異，利用ggplot2包進(jìn)行可視化。比較相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分在各種酒醅中的分布差異，利用Circlize包進(jìn)行可視化；利用STAT包中t檢驗(yàn)函數(shù)進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅揮發(fā)性成分分析

出窖酒醅和入窖酒醅的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖如圖1所示。計(jì)算各酒醅樣品中的揮發(fā)性成分的峰面積相對百分比，為消除含量過低的成分對差異分析的干擾，將相對百分含量≥0.01%的成分作為酒醅中主要揮發(fā)性成分，結(jié)果見表1。

圖1 出窖酒醅和入窖酒醅揮發(fā)成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in unloading pits and loading pits analyzed by GC-MS

由表1可知，不同來源的出窖和入窖酒醅共檢出42種主要揮發(fā)性成分，其中醇類6種、酸類4種、醛酮類8 種、酯類23種、醚類1種；出窖酒醅中檢出41種，入窖酒醅中檢出27種。酯類中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯的相對百分含量均在2%以上，它們正是濃香型白酒的特征香氣成分[3，24-25]。由于己酸乙酯和乳酸乙酯相對于乙酸乙酯和乙醇揮發(fā)性低，在蒸餾過程中在酒醅中殘留比例高于乙醇，因此在兩個(gè)來源的入窖酒醅中相對百分含量都增加，這與郎召偉等[5]的報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)樣品中檢出的醛酮類揮發(fā)性成分均為五碳以下的醛酮。兩個(gè)來源的入窖酒醅中乙酸、丁酸、己酸這三種酸的相對含量都增加，這是由于酸類物質(zhì)的沸點(diǎn)高，在蒸餾后酒醅中積累進(jìn)入下一輪發(fā)酵。

表1 不同來源酒醅主要揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results main volatile compounds in fermented grains from different sources

續(xù)表

2.2 不同來源樣品間的差異分析

2.2.1 樣品揮發(fā)性成分多樣性差異

由圖2可知，不同來源的出窖酒醅距離接近，說明雖然來源不同，但同種香型的出窖酒醅在揮發(fā)性成分多樣性上的差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于出窖和入窖間的差異。不同來源的入窖酒醅距離較遠(yuǎn)，說明不同來源入窖酒醅在揮發(fā)性成分多樣性上存在較大差異，但這種差異要小于出窖酒醅和入窖酒醅在揮發(fā)性成分多樣性上的差異。入窖酒醅間的差異有可能是由于蒸酒工藝不同、原料配比差異、大曲來源不同等原因造成的。出窖酒醅間的相似性說明出窖酒醅中揮發(fā)性成分的多樣性不會受到入窖酒醅揮發(fā)性成分多樣性的干擾。

圖2 不同酒醅揮發(fā)性成分多樣性主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.2 Principal coordinates analysis results of volatile compounds diversity of different fermented grains

2.2.2 樣品揮發(fā)性成分類別差異

將酒醅中的揮發(fā)性成分劃分為醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類，并計(jì)算各類的相對百分含量，對樣品揮發(fā)性成分的醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類進(jìn)行主坐標(biāo)分析（如圖3（a）），以展示樣品在揮發(fā)性成分類別上的差異。除乙醇外酒醅中的揮發(fā)性成分可以歸結(jié)為酒醅香氣成分[8]。將酒醅香氣成分按官能團(tuán)分劃分為醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類，并計(jì)算各類的相對百分含量。對樣品香氣成分的醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類進(jìn)行主坐標(biāo)分析（如圖3（b）），以展示樣品在香氣成分類別上的差異。

由圖3（a）可知，不同來源的出窖酒醅間、不同來源的入窖酒醅間的距離與出窖入窖酒醅間距離接近，說明無論出窖入窖、無論哪種來源，樣品在揮發(fā)性成分分類上不存在明顯差異。這主要是由于無論出窖入窖、哪個(gè)來源的酒醅，乙醇都是揮發(fā)性成分中占比最多的成分，且占比接近，與其他成分的占比存在數(shù)量級的差異，因此乙醇掩蓋了其他成分給酒醅帶來的差異。由圖3（b）可知，在僅考慮香氣物質(zhì)時(shí)，各樣品間的距離有明顯區(qū)別。不同來源的出窖酒醅幾乎重合，不同來源的入窖酒醅距離較遠(yuǎn)，但小于出窖入窖酒醅的距離。說明不同來源的入窖酒醅在各類香氣成分的相對占比上也存在差異，但出窖酒醅的各類香氣成分占比不受該差異的影響。

圖3 不同酒醅揮發(fā)性成分類別主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.3 Principal coordinates analysis results of volatile compounds classification of different fermented grains

2.2.3 差異性成分分布

由圖4可知，兩種來源的出窖酒醅（S_1和S_3）在相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分的分布上比較接近，酒醅S_3揮發(fā)性成分中由于乙醇占比較高，其他香氣成分（除乙酸外）的相對百分含量略低于酒醅S_1，酒醅S_1和S_3的揮發(fā)性成分中乙酸的相對百分含量接近。經(jīng)成對樣本t檢驗(yàn)可知，酒醅S_1和S_3的主要揮發(fā)性成分在分布上差異不顯著（P=0.475＞0.05），可見同一香型的白酒出窖酒醅即使來自不同生產(chǎn)企業(yè)，在相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分分布上也具有相似性。兩種來源的入窖酒醅（S_2和S_4）在相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分的分布上差異明顯，酒醅S_4的主要揮發(fā)性成分種類多于S_2。經(jīng)成對樣本t檢驗(yàn)可知，酒醅S_2在乙醇、乳酸乙酯和乙酸的分布上顯著高于酒醅S_4（P=0.035＜0.05），在其他相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分的分布上顯著低于酒醅S_4（P=0.028＜0.05），說明不同來源的入窖酒醅在相對百分含量＞1%的揮發(fā)性成分上差異顯著。可見同種香型的白酒，雖然不同來源的入窖酒醅在揮發(fā)性成分分布上有較大差異，但這并不會顯著影響出窖酒醅中揮發(fā)性成分的分布。

圖4 不同酒醅中揮發(fā)性成分的分布Fig.4 Distribution of volatile compounds in different fermented grains

3 結(jié)論

濃香型白酒在采用同樣的原料、大曲和發(fā)酵工藝時(shí)，不同來源的出窖酒醅在揮發(fā)性成分的多樣性、香氣成分類別、主要揮發(fā)性成分分布上差異均不明顯。不同來源的入窖酒醅在揮發(fā)性成分多樣性上、香氣成分類別上有差異，在主要揮發(fā)性成分分布上差異顯著，但這種差異不足以改變出窖酒醅的揮發(fā)性成分。因此可以認(rèn)為入窖酒醅的揮發(fā)性成分對出窖酒醅的揮發(fā)性成分不會產(chǎn)生顯著影響。本文研究成果能為濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵的工藝控制提供一定參考。