尹樂斌，楊愛蓮，劉 丹，廖 聰，李樂樂，何 平，劉椏麗

（1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000）

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，化工、食品、養(yǎng)殖、電子等企業(yè)每日排放各種廢水[1]，其有毒有害物質(zhì)給生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重傷害。傳統(tǒng)的無機(jī)鹽類（如鋁鹽系絮凝劑）、有機(jī)高分子（如聚丙烯酰胺）絮凝劑在污水治理中被普遍使用，但對人類健康以及生態(tài)環(huán)境存在一定的危害[2-3]。微生物絮凝劑是由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的產(chǎn)物，主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、核酸等[4]，具有高效、無毒、無二次污染、可生物降解等特點，是一種安全的綠色水處理劑。其在食品[5]、重金屬[6]、制漿[7]、染料[8]等廢水處理中均有應(yīng)用，且取得良好的效果。然而，微生物絮凝劑發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑因菌種穩(wěn)定性差、絮凝能力低和培養(yǎng)成本高，導(dǎo)致其工業(yè)化實現(xiàn)較困難。所以，在挖掘新的優(yōu)良產(chǎn)絮菌的同時，廉價、無毒無害的替代營養(yǎng)基質(zhì)也很重要。因此，食品加工廢水成為微生物絮凝劑培養(yǎng)替代營養(yǎng)基質(zhì)的首選，目前已報道的有釀酒黃水[9]、糖蜜及啤酒廢水[10]、花生殼水解液[11]等，且成效顯著。

我國是豆制品生產(chǎn)大國，每生產(chǎn)1 t大豆制品就會產(chǎn)生1 t左右的泡豆廢水、4～5 t的豆清液和10 t的左右的清潔廢水，其中豆清液中富含有豐富的植物蛋白、氨基酸、脂肪酸等有機(jī)物質(zhì)，化學(xué)需氧量（8 000～20 000 mg/L）、生化需氧量（5 000～8 000 mg/L）極高，處理難度大[12]。其作為廢水排放，既嚴(yán)重污染環(huán)境，又浪費大量的營養(yǎng)物質(zhì)。

鑒于此，本研究利用平板劃線分離方法，在豆制品加工基地的活性污泥及附近土壤樣品中分離篩選出一株高效生產(chǎn)絮凝劑的菌株，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，探究其利用豆清液產(chǎn)微生物絮凝劑，旨在為微生物絮凝劑產(chǎn)絮菌基因庫提供新的優(yōu)良菌株的同時也為豆制品廢水綠色處理提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及廢水

菌種：從豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室的活性污泥及附近土壤中篩選、分離獲得。

豆制品廢水（豆清液）：豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鈉、硫酸銨、七水硫酸鎂、葡萄糖、酵母粉、尿素：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水氯化鈣、高嶺土、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15～20 g/L、水1 L，pH 7.0～7.2。121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L，水1 L，pH值7.0。121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏0.5 g/L、K2HPO45 g/L、MgSO40.2 g/L、KH2PO42 g/L、NaCl 0.1 g/L、尿素0.2 g/L、（NH4）2SO40.2 g/L，pH 8.0。108 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DWS全自動滅菌鍋：長沙艾迪生物科技有限公司；D-7PC紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱、101-1電熱恒溫鼓風(fēng)箱：北京中興偉業(yè)儀器公司；BA210生物顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；IS-AX恒溫振蕩器：蘇州捷美電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的分離、篩選[13]

分離：取適量樣品用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，取3個適宜的稀釋度（10-5、10-6、10-7）涂布于PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的分離平板中，分別在30 ℃和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別分離出真菌和細(xì)菌，然后挑取單獨的菌株進(jìn)行多次平板劃線分離純化。將純菌株于斜面試管中保存、編號，4 ℃保存。

篩選：將純菌株分別接入到裝液量為50 mL/150 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，真菌于30 ℃、細(xì)菌于37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)72 h。選取發(fā)酵液對高嶺土懸濁液絮凝效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 菌株鑒定

觀察PDA平板菌落形態(tài)、顯微鏡觀察菌體形態(tài)、16SrDNA序列測定，確定絮凝劑產(chǎn)生菌的種屬，菌株基因序列測定由生工（上海）股份有限公司完成。

1.3.3 絮凝活性分布[14]

將發(fā)酵液于離心機(jī)8 000 r/min離心20 min，分離上清液和菌細(xì)胞，一部分菌細(xì)胞加入等體積水制成菌細(xì)胞懸液，另一部分菌細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次，再加入等體積的水制成菌細(xì)胞懸液。以蒸餾水作對照，對發(fā)酵原液、離心上清液、菌細(xì)胞懸液以及洗滌3次后的菌細(xì)胞懸液進(jìn)行絮凝率測定，以確定菌株產(chǎn)絮凝活性物質(zhì)的分布情況。

1.3.4 絮凝率的測定方法

根據(jù)周俊利等[15]的方法，略有改動。高嶺土懸濁液質(zhì)量濃度4 g/L，取20 mL高嶺土懸濁液置于25 mL燒杯中，再加入0.8 mL 10%的CaCl2溶液和0.4 mL發(fā)酵液，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? min，靜置10 min，在液面同一刻度下取液體于波長550 nm條件下測定吸光度值。以蒸餾水代替發(fā)酵液，其他條件相同作為對照。絮凝率計算公式如下：

式中：A表示對照組上清液在波長550 nm處的吸光度值，B表示樣品組上清液在波長550 nm處的吸光度值。

1.3.5 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

單因素試驗：以豆制品廢水為培養(yǎng)基，優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)條件。以培養(yǎng)菌株后的發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝率為評價指標(biāo)，分別考察豆制品廢水添加量（20%、40%、60%、80%、100%）、菌液接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、培養(yǎng)基初始pH值（5、6、7、8、9）、培養(yǎng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、轉(zhuǎn)速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）以及培養(yǎng)時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）對絮凝效果的影響，從而確定該產(chǎn)絮菌的最佳條件。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇影響因素較大的培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、轉(zhuǎn)速（C）以及培養(yǎng)時間（D），采用L9（34）正交試驗設(shè)計，進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

1.3.6 菌株J-7產(chǎn)物的提取及成分分析

將發(fā)酵液進(jìn)行8 000 r/min離心20 min，向上清液中加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4 ℃靜置過夜。離心取沉淀，蒸餾水溶解，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇溶液（氯仿與正丁醇體積比為5∶2），靜置過夜，有機(jī)溶劑層加入1∶2的無水乙醇，靜置24 h。再離心取沉淀，-45～-20 ℃的溫度下真空冷凍干燥3 d，制得微生物絮凝劑[14，16]。

將微生物絮凝劑配制成1 g/L溶液，糖類的定性測定采用蒽酮反應(yīng)、莫立許反應(yīng)，蛋白質(zhì)的定性測定采用雙縮脲反應(yīng)、茚三酮試驗[17-18]，以及進(jìn)行紫外光譜掃描、紅外光譜分析表征其成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選結(jié)果

采用平板劃線分離法，分離出33株菌株，將其編號為J-1～J-33，以發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝效果，根據(jù)菌株發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝效果篩選出4株具有絮凝活性的菌株，分別為菌株J-2、J-4、J-6、J-7。菌株J-6、J-7絮凝率最高，初篩復(fù)篩均達(dá)到70%以上。通過觀察其絮凝沉淀體，菌株J-6絮凝沉淀礬花細(xì)小，易松散。而菌株J-7 絮體沉淀礬花大緊實且絮凝效率最快，故以菌株J-7為后續(xù)實驗的研究對象。

2.2 菌株的鑒定

由圖1A可知，為菌株J-7在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落中心有突起，質(zhì)地絮狀，菌絲體初期為白色，漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色、黃色，生長7 d后變?yōu)槟G色。由圖1B可知，其孢子梗為帚狀枝雙輪生或單輪生。

圖1 菌株J-7的菌落（A）及孢子（B）形態(tài)Fig.1 Colony (A) and spore (B) morphology of strain J-7

將菌株J-7進(jìn)行16S rDNA序列測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性對經(jīng)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株J-7的序列與菌株Talaromyces pinophilusMF093899.1的序列親緣性最高，相似度為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察，菌株J-7 被鑒定為Talaromyces pinophilus。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株J-7的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain J-7 based 16S rDNA gene sequence

2.3 絮凝活性分布結(jié)果

菌株J-7絮凝活性分布的試驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵液原液、離心上清液、離心后洗滌及未洗滌的菌細(xì)胞懸液均有一定的絮凝效果，且前三者的絮凝效果相差不大，而洗滌3次后的菌細(xì)胞懸液絮凝率大幅度降低。結(jié)果表明，菌株J-7所產(chǎn)生的絮凝活性成分主要分布于上清液中，為微生物的生長代謝產(chǎn)物，而非菌體本身。此結(jié)果與武曉暢等[19-21]的結(jié)果一致，微生物絮凝劑主要成分為菌細(xì)胞的胞外產(chǎn)物。

圖3 菌株J-7的絮凝活性分布Fig.3 Flocculating activity distribution of strain J-7

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.4.1 不同廢水添加量對絮凝效果的影響

由圖4可知，絮凝率隨著豆制品廢水添加量的增加，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在添加量為60%時，絮凝率達(dá)最大值73.76%。當(dāng)廢水添加量＞60%時，絮凝率呈下降趨勢。豆制品廢水屬于一種有機(jī)物含量高的廢水，濃度越高，其滲透壓越大，則菌體生存繁殖受到抑制，從而抑制了其代謝產(chǎn)物的分泌。因此，最適廢水添加量為60%。

圖4 不同廢水添加量對絮凝效果的影響Fig.4 Effect of different waste water addition on flocculation

2.4.2 不同接種量對絮凝效果的影響

接種量對菌株J-7產(chǎn)微生物絮凝劑的影響如圖5所示，接種量在1%～5%范圍內(nèi)，其絮凝率表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在接種量為4%時，絮凝率達(dá)到最大值，為75.04%。接種量過小，菌株在短期內(nèi)還沒適應(yīng)環(huán)境，絮凝率偏低。接種量過大，菌株快速生長繁殖，適應(yīng)期縮短，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)有限，細(xì)胞之間相互爭奪營養(yǎng)，不利于代謝產(chǎn)物的生成和積累，也加速了菌株的老化，從而導(dǎo)致絮凝率下降[22]。因此，控制適合的菌種接種量，才能有益于微生物的生長，提高絮凝物質(zhì)的產(chǎn)量和活性。因此，最適接種量為4%。

圖5 接種量對絮凝效果的影響Fig.5 Effect of inoculum on flocculation

2.4.3 不同培養(yǎng)基pH對絮凝效果的影響

由圖6可知，在初始pH 5～9范圍內(nèi)，菌株J-7發(fā)酵液的絮凝率表現(xiàn)為先升高再降低，在pH值為6時達(dá)到最大值，當(dāng)pH＞7時，絮凝率有所下降，總體表現(xiàn)為酸性環(huán)境下更適于菌株J-7生長代謝產(chǎn)絮凝劑，堿性環(huán)境不利于絮凝劑的合成積累。原因可能為環(huán)境pH值的高低直接影響菌細(xì)胞表明的電荷、細(xì)胞壁通道大小、有機(jī)物的離子化作用以及某些生物酶的活性，導(dǎo)致微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力降低，從而影響代謝物的分泌[23]。因此，最適培養(yǎng)基初始pH值為6。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對絮凝效果的影響Fig.6 Effect of medium initial pH value on flocculation

2.4.4 不同培養(yǎng)溫度對絮凝效果的影響

溫度的高低會直接對微生物的生長代謝產(chǎn)生重要的影響。由圖7可知，在溫度為20～40 ℃時，隨著溫度的上升，絮凝率出現(xiàn)先上升再降低的趨勢，且在25～35 ℃時其發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝率較好，絮凝率均＞70%，并在溫度為25 ℃時絮凝率達(dá)到最大。低溫環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的某些酶不能很好的發(fā)揮其活性，代謝速率緩慢。溫度過高，會導(dǎo)致菌株內(nèi)某些生物酶變性失活，從而使產(chǎn)物的合成受到影響[16]。因此，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。

圖7 培養(yǎng)溫度對絮凝效果的影響Fig.7 Effect of culture temperature on flocculation

2.4.5 不同轉(zhuǎn)速對絮凝效果的影響

由圖8可知，在搖床轉(zhuǎn)速為90～210 r/min時，絮凝率呈先增高再降低的趨勢，在150 r/min時，絮凝率達(dá)到最大值，為80.36%，超過這個值，絮凝率大幅度下降。搖床轉(zhuǎn)速主要為對菌株的供氧過程，轉(zhuǎn)速過慢，氧氣供不應(yīng)求，菌株不能正常的生長代謝，絮凝率低；轉(zhuǎn)速過快，培養(yǎng)體系內(nèi)離心作用過于強(qiáng)烈，不利于菌株正常的生長[17]。選擇適宜的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，減少對菌株損傷程度，有利于絮凝劑的累積。因此，最適轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖8 轉(zhuǎn)速對絮凝效果的影響Fig.8 Effect of rotation speed on flocculation

2.4.6 不同培養(yǎng)時間對絮凝效果的影響

不同種類的微生物，分泌絮凝物質(zhì)的時間各有不同。由圖9可知，菌株J-7在24～96 h內(nèi)，絮凝率先增大后降低。豆制品廢水本身是一種無毒無害且營養(yǎng)豐富的有機(jī)廢水，是大多數(shù)微生物的理想培養(yǎng)基。在24～48 h范圍內(nèi)，培養(yǎng)基營養(yǎng)充足，利于菌株J-7生長繁殖，絮凝率大幅度增加，并在48 h時絮凝率最大，為86.78%。48～72 h內(nèi)，大部分營養(yǎng)物質(zhì)被消耗完，此時菌株濃度高，相互競爭，生長受限抑制，代謝產(chǎn)物減少，導(dǎo)致絮凝率降低。72 h之后，菌細(xì)胞濃度達(dá)到平衡，絮凝率慢慢趨于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間為48 h。

圖9 培養(yǎng)時間對絮凝效果的影響Fig.9 Effect of culture time on flocculation

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

為優(yōu)化菌株J-7利用豆制品廢水產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)條件，根據(jù)單因素試驗，以絮凝率為評價指標(biāo)，選擇培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基初始pH 值（B）、轉(zhuǎn)速（C）以及培養(yǎng)時間（D）4個因素，按照正交設(shè)計L9（34）進(jìn)行試驗，正交試驗結(jié)果及方差分析見表2。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表2可知，各因素對菌株J-7產(chǎn)絮凝劑能力的影響主次因素順序為：培養(yǎng)時間＞培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞轉(zhuǎn)速。其中正交試驗表中第4組，即A2B1C2D3組合的絮凝率最高，達(dá)到91.15%，但根據(jù)極差分析，該菌株的最佳培養(yǎng)條件組合為A2B1C2D2，即溫度25 ℃、初始pH值5、轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵48 h。在此最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，發(fā)酵液絮凝率達(dá)到93.42%。

2.6 微生物絮凝劑成分分析及結(jié)構(gòu)表征

對微生物絮凝劑分別進(jìn)行糖類和蛋白質(zhì)的定性檢測試驗，結(jié)果見表3。由表3可知，莫立許反應(yīng)、蒽酮反應(yīng)為檢驗樣品中是否含有糖類物質(zhì)，它們能與糖類物質(zhì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而證明是否存在糖類，而這兩種反應(yīng)均出現(xiàn)陽性，發(fā)生顏色反應(yīng)，說明該絮凝劑含有糖類物質(zhì)；雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生呈色反應(yīng)，在此結(jié)果中兩種反應(yīng)均為陰性，沒有顏色變化，說明該樣品不含蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)含量極少。

表3 絮凝劑的定性分析結(jié)果Table 3 Qualitative analysis results of flocculants

由圖10可知，該絮凝劑為一條較為光滑的吸收曲線，在波長260 nm處無明顯吸收峰，在280 nm處有微弱的吸收峰，說明絮凝物中有微量的蛋白質(zhì)，表明不含有核酸物質(zhì)[14，24]，初步判斷該絮凝劑的主要成分為多糖類物質(zhì)。

圖10 絮凝劑紫外光譜分析Fig.10 Ultraviolet spectrum analysis of flocculants

由圖11可知，該絮凝劑在波數(shù)為3 269.41 cm-1處有一個吸收峰，表明分子間有-OH的存在；在波數(shù)為2 929.82 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)度較弱的吸收峰為C-H的伸縮振動峰，為飽和C-H伸縮振動的信號，可能存在碳水化合物；在波數(shù)為1643.33cm-1和1 317.23 cm-1處的吸收峰分別為C=O不對稱伸縮振動和C=O對稱伸縮振動，其中在波數(shù)為1 643.33 cm-1處的峰與蛋白質(zhì)和氨基糖中-CONH-官能團(tuán)的C=O伸縮振動有關(guān)；在波數(shù)為1 077.38 cm-1處有吸收峰，表明該物質(zhì)含有C-O和C-N官能團(tuán)的存在[25-27]。綜上所述，表明該絮凝劑含有羰基、羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)，而這些基團(tuán)存在可能對絮凝分子的吸附效果有促進(jìn)作用。

圖11 絮凝劑紅外光譜分析Fig.11 Infrared spectrum analysis of flocculants

3 結(jié)論

采用平板劃線法分離篩選出一株產(chǎn)絮凝劑的高效絮凝菌J-7，其發(fā)酵液對高嶺土懸液具有較好的絮凝效果，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA基因測序，菌株J-7被鑒定為Talaromyces pinophilus。該菌株能夠在豆制品廢水中良好生長繁殖，產(chǎn)生具有絮凝活性的物質(zhì)，最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25 ℃，初始pH值5，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間48 h。在此優(yōu)化條件下，其發(fā)酵液絮凝率可達(dá)到93.42%。對提純后的絮凝劑進(jìn)行定性測定、紫外光譜掃描及紅外光譜分析結(jié)果表明其主要成分為多糖，其中含有羰基、羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)。