戚夢婷，侯 豹，蔡維維，孫姜楠，艾 敏，馬欣雨，邱麗穎

(1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2 江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

王不留行是石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子，其主要功效為活血通絡(luò)，下乳消腫，利尿通淋等[1]。王不留行中主要含有三萜皂苷、環(huán)肽、類脂、多糖、黃酮苷和刺桐堿等[2]。其中黃酮苷和刺桐堿是具有多種藥理作用，黃酮苷具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖[3]，在開放性創(chuàng)傷的治療中取得了顯著的效果[4]，刺桐堿可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5-6]。

已有研究對刺桐堿提取工藝研究較多，但提取工藝比較復(fù)雜，耗材較多[7-8]，不適宜工業(yè)生產(chǎn)。中國藥典中也對王不理行黃酮苷和刺桐堿的提取分離以及效用做了詳細(xì)說明，但其提取工藝應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)還缺乏理論數(shù)據(jù)支持。因此本實(shí)驗(yàn)選擇通過索式提取[9]考察了生和炒王不留行的含油量，選擇含油量較低的生王不留行在室溫下通過乙醇浸漬法提取王不留行黃酮苷和刺桐堿，并用高效液相色譜法同時測定黃酮苷和刺桐堿含量，為工業(yè)化提取提供參考。

1 材料與試藥

Waters 1525高效液相色譜儀，Waters公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SZ-1000A-3超高速多功能粉碎機(jī)，永康市善竹貿(mào)易有限公司；AX124ZH/E電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Milli-Q純水儀，Millipore公司；KQ-800KDE高功率數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；BZF-50真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限有限公司。

王不留行，安國慶藥源商貿(mào)有限公司；黃酮苷對照品(純度>98%)，上海土鋒生物科技有限公司；刺桐堿對照品(純度>98%)，上海土鋒生物科技有限公司；甲醇(HLPC級)，Adamas公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 索氏抽提測生王不留行和炒王不留行種子的含油量

分別取生王不留行和炒王不留行約3 g，研磨并置于濾紙中，加入50 mL石油醚，在65 ℃下提取5.5 h，計(jì)算其含油率。

2.2 建立同時測定黃酮苷和刺桐堿含量的HPLC測定方法

色譜條件：色譜柱為X-Bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)；按照中國藥典收錄的檢測方法，以甲醇為流動相A，0.3%磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫(0～10 min、35%A，10～20 min、35%～40%A，20～35 min、40%～50%A)；檢測波長為280 nm，檢測波長流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 溶液的制備

分別精密稱取黃酮苷和刺桐堿5 mg，置于50 mL容量瓶中加70%甲醇水溶液溶解定容搖勻即得對照品混合溶液。準(zhǔn)確稱取樣品50 mg用70%甲醇定溶于50 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察

再分別稀釋成1、12.5、25、50、100 μg/mL對照品溶液進(jìn)樣。以黃酮苷和刺桐堿的濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃酮苷回歸方程為Y= 22949x-2488.2，R2=1；刺桐堿的回歸方程為Y=24004x-6249.1，R2=0.9999，黃酮苷和刺桐堿在1～100 μg/mL濃度范圍與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 單因素考察

(1)準(zhǔn)確稱取5份王不留行種子粗粉，每份10 g，固定乙醇濃度為75%，提取3天。分別以料液比為1:6、1:8、1:10、1:12、1:14提取，考察提取料液比對提取王不留行中黃酮苷和刺桐堿含量的影響。

(2)準(zhǔn)確稱取5份王不留行粗粉，每份10 g，固定料液比為1:10，乙醇濃度為75%，考察提取時間對提取王不留行中黃酮苷和刺桐堿含量的影響。

(3)準(zhǔn)確稱取5份王不留行粗粉，每份10 g，固定料液比為1:10，提取3 d，考察乙醇濃度對提取王不留行中黃酮苷和刺桐堿含量的影響。

2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)L9(34)，以提取料液比、提取時間、乙醇濃度為3因素，每個因素選擇三個水平設(shè)計(jì)正交表見表1。正交試驗(yàn)以黃酮苷和刺桐堿含量及干粉得率為評價指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分配為黃酮苷刺桐堿的含量各占0.45，干粉得率占0.1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝提取三次，考察方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3 結(jié)果與討論

3.1 王不留行種子中含油量測定

經(jīng)檢測生王不留行和炒王不留行含油量分別為2.8471%、3.2492%。生王不留行和炒王不留行含油量都低于百分10%，為了減少常規(guī)石油醚脫脂步驟，減少污染，因此選用生王不留行種子提取黃酮苷和刺桐堿。

3.2 王不留行黃酮苷和刺桐堿色譜圖

王不留行黃酮苷和刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜見圖1A，生王不留行種子提取物HPLC指紋圖譜見圖1B。

圖1 王不留行黃酮苷和刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)品(A)及

3.3 單因素考察結(jié)果

分別以料液比為1:6、1:8、1:10、1:12、1:14提取，結(jié)果如圖2A所示黃酮苷和刺桐堿含量都隨著溶劑增大而增大在料液比1:12時達(dá)到最大，而當(dāng)料液比1:14時黃酮苷和刺桐堿的提取量并沒有隨之增大，因此選擇1:10、1:12、1:14進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

分別以提取時間為1、2、3、4、5 d提取，考察提取時間對提取王不留行中黃酮苷和刺桐堿含量的影響。如圖2B所示在第3天達(dá)到最高，因此，選擇含量最高的2、3、4天作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

分別以乙醇濃度為55%、65%、75%、85%、95%提取，考察乙醇濃度對提取王不留行中黃酮苷和刺桐堿含量的影響。如圖2C所示，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到75%時黃酮苷和刺桐堿的含量達(dá)到最大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到85%和95%時，黃酮苷和刺桐堿的提取量反而降低。因此選擇65%、75%、85%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比、時間、乙醇濃度對提取黃酮苷和刺桐堿含量的影響

3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析見表2和表3，綜合極差和方差分析知浸漬法提取王不留行黃酮苷和刺桐堿含量影響因素程度為A(料液比)>C(乙醇濃度)>B(時間)，料液比對王不留行黃酮苷和刺桐堿含量有顯著影響。綜合直觀分析和方差分析可以確定浸漬法提取王不留行黃酮苷和刺桐堿最佳提取工藝為A3B3C2，即料液比1:14，提取時間4 d，乙醇濃度75%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

如表4所示為三次平行試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果選定最佳提取工藝料液比1:14，提取時間4 d，乙醇濃度75%的最佳提取工藝穩(wěn)定可靠。

表4 最佳提取工藝穩(wěn)定性考察表

4 結(jié) 論

王不留行黃酮苷和刺桐堿因?yàn)槠淞己玫乃幮Ф艿娇蒲泄ぷ髡叩膹V泛關(guān)注。對其需求量也逐漸增加，因此開發(fā)一個可工業(yè)化提取的生產(chǎn)工藝迫在眉睫。本研究選擇不同的藥液比、乙醇濃度、提取時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出了浸漬法

提取王不留行黃酮苷和刺桐堿的最佳提取工藝為料液比1:14，提取時間4 d，乙醇濃度75%。黃酮苷和刺桐堿在最佳提取工藝下的含量分別為5.37 mg/g和1.22 mg/g，為工業(yè)生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)，提供了數(shù)據(jù)支撐。本研究提取起方法簡易、耗能少、成本低，具有很好的工業(yè)化價值。但浸漬法提取也存在耗時較長的缺點(diǎn)，且本實(shí)驗(yàn)是在室溫直接使用粗粉進(jìn)行提取，在溫度和粉碎粒度等因素方面還有待進(jìn)一步的考察。