曹新春 郭偉勝

BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid cancer，PTC）在所有PTC病例中占40%～80%[1]，具有較高的復發(fā)率和較低的生存率，預后較差[2，3]。目前國內(nèi)外公認PTC的主要治療方式為甲狀腺部分或完全切除術(shù)，其次通過用放射性131I治療消除殘余甲狀腺癌組織，術(shù)后終身服用甲狀腺激素替代治療，可以使大部分患者的5年生存率提高到97.8%[4]，但同時要面臨手術(shù)并發(fā)癥較多的風險。中藥華蟾素是從中華大蟾蜍蟾酥中分離出的天然藥物，具有清熱解毒、消腫、止痛、提高機體免疫力等功能。目前華蟾素在臨床上主要應用于肝癌、肺癌、食管癌等腫瘤的綜合治療中，但BRAFV600E基因突變的高風險PTC的相關中醫(yī)藥治療研究中較少。本研究從華蟾素對BRAFV600E基因突變型PTC增殖、遷移、侵襲的影響及其分子機制展開研究，以期揭示華蟾素在BRAFV600E基因突變型PTC的發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為PTC的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）；NanoDrop 2000（美國Thermo公司）；華蟾素注射液（安徽金蟾生化股份有限公司）；DNase I、RNase A、Trizol（Invitrogen公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶（德國Sigma公司）；CCK-8細胞檢測試劑盒、Fast-FusionTMClonase（廣州復能基因有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復蘇及培養(yǎng) 所用細胞為BRAFV600E基因突變型人PTC細胞B-CPAP，使用添加10%胎牛血清+1%雙抗的RPMI-1640于37℃、相對濕度95%、5% CO2恒溫培養(yǎng)條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。將細胞進行傳代使細胞的融合度達到80%～90%，根據(jù)細胞的密度決定傳代的數(shù)量。

1.2.2 CCK-8細胞活力檢測 將制備好的細胞懸液接種到96孔板中，培養(yǎng)2h后加藥處理。分為6個組，所有組均予DMSO，對照組（無其他處理）、20nM華蟾素處理組、0.25nM阿霉素處理組、0.25nM卡鉑處理組、20nM華蟾素+0.25nM阿霉素處理組、20nM華蟾素+0.25nM卡鉑處理組。將6種處理的96孔板分別置于37℃培養(yǎng)箱，于5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h、48h、72h時分別加入CCK-8溶液10μl，孵育3～4h。在酶標儀上測定細胞的吸光值（450nm波長處）。以上實驗各重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用流式細胞術(shù)(AnnexinV-FITC/PI聯(lián)合標記)檢測細胞凋亡情況：根據(jù)CCK8細胞活力檢測結(jié)果，選取適當濃度進行后續(xù)試驗，將經(jīng)華蟾素注射液處理48h的實驗組及對照組的B-CPAP細胞分別收集于離心管中，于室溫下1 000r/min離心5min，棄上清液，用預冷的PBS洗1次，經(jīng)400目篩網(wǎng)濾過后移入已硅化的玻璃管中，取1×106個細胞，1 000r/min離心5min，洗滌細胞，棄上清，加入5μl AnnexinV-FITC染色劑，混勻后避光，室溫孵育15min，上機前5min加入碘化丙啶（PI）染色劑，于4℃下避光染色，4h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 細胞遷移檢測 采用細胞劃痕實驗檢測華蟾素對BRAFV600E基因突變型人PTC細胞B-CPAP遷移能力的影響。首先取細胞密度約為1×105的細胞懸液1ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后加入RPMI-1640培養(yǎng)液，使形成單層細胞，用10μl無菌槍頭在單層細胞上垂直劃線，沿壁緩慢加入PBS清洗脫落的細胞，向?qū)φ战M加入100μl PBS，實驗組加入不同濃度的華蟾素，置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，于培養(yǎng)剛開始和培養(yǎng)后48h對細胞進行觀察拍照。

細胞遷移率RM=（Wi-Wf）/Wi，RM為細胞遷移率，Wi為0h劃痕寬度，Wf為48h劃痕寬度。

1.2.5 細胞侵襲實驗 采用Transwell實驗檢測華蟾素對B-CPAP細胞侵襲能力的影響。細胞進入對數(shù)生長期后，將血清撤除24h，使其饑餓，逐步消除實驗過程中血清可能造成的影響；用PBS對細胞進行3次洗滌后，使用0.25%胰消化酶處理，消化停止后離心收集細胞，將培養(yǎng)液上清移除，用PBS洗滌3次，導入2ml無血清培養(yǎng)基，充分制備所需單細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整至2×105個/ml；將100μl和500μl不同濃度的華蟾素注射液分別加入上、下室，各組設定復孔共3個；將細胞置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃孵育，對小室內(nèi)細胞進行觀察，培養(yǎng)24h和48h時分別分組將細胞從小室取出，結(jié)晶紫染色后計數(shù)；小室風干之后反轉(zhuǎn)，用倒置顯微鏡顯微觀察，隨機選擇觀察視野5個拍照并計數(shù)，以穿過膜的細胞數(shù)目來評估細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用LSD-t檢驗和單因素方差分析進行數(shù)據(jù)之間的比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素對PTC細胞的遷移和侵襲影響細胞劃痕實驗結(jié)果顯示（見圖1），對照組的RM為0.98±0.069，20nM華蟾素處理后的RM為0.97±0.185，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.124，P=0.912）。Transwell實驗結(jié)果見圖2，對照組的細胞數(shù)為（476±76）個，華蟾素處理組細胞數(shù)為（453±46）個，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.5789，P=0.5786）。

圖1 細胞劃痕實驗結(jié)果

圖2 Transwell實驗結(jié)果

2.2 華蟾素對PTC化療敏感性影響采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒對華蟾素干預后化療藥物阿霉素或卡鉑處理下B-CPAP細胞的細胞活力進行檢測。細胞活力結(jié)果顯示（見表1），20nM華蟾素與0.25nM阿霉素聯(lián)合干預下的B-CPAP細胞在72h的OD450值為0.555±0.041，顯著低于阿霉素處理下細胞的OD450值0.753±0.053（t=5.118，P=0.0069）；而72h的華蟾素與卡鉑聯(lián)合干預下的B-CPAP細胞的OD450值為0.620±0.093，與卡鉑處理下細胞的OD450值0.657±0.070比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.5506，P=0.6112）。華蟾素與卡鉑聯(lián)合干預下的B-CPAP細胞在48h的OD450值為0.360±0.056，顯著低于卡鉑處理下細胞的OD450值0.477±0.012（t=3.538，P=0.024）。以上結(jié)果表明，阿霉素處理下B-CPAP細胞的活力在華蟾素干預后顯著降低。

表1 CCK-8檢測華蟾素處理下化療藥物對甲狀腺乳頭狀癌細胞處理后的吸光度值

表1 CCK-8檢測華蟾素處理下化療藥物對甲狀腺乳頭狀癌細胞處理后的吸光度值

組別OD450值（0h）OD450值（24h）OD450值（48h）OD450值（72h）對照組0.231±0.0190.314±0.0120.496±0.0350.837±0.038華蟾素組0.264±0.0310.274±0.0410.598±0.0510.899±0.042阿霉素組0.136±0.0120.261±0.0310.451±0.0470.753±0.053阿霉素+華蟾素組0.241±0.0170.237±0.0470.357±0.0180.555±0.041卡鉑組0.249±0.0140.246±0.0230.477±0.0120.657±0.070卡鉑+華蟾素組0.242±0.0160.267±0.0.350.360±0.0560.620±0.093

2.3 華蟾素對PTC細胞凋亡的影響華蟾素組B-CPAP細胞的凋亡率為（14.900±2.858）%，與對照組的細胞凋亡率（14.400± 0.755）%比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.2930，P=0.7841）；卡鉑聯(lián)合華蟾素組B-CPAP細胞的凋亡率為（23.800±1.375）%，與卡鉑組的凋亡率（19.370±4.186）%相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.741，P=0.1566）；阿霉素聯(lián)合華蟾素組B-CPAP細胞的凋亡率為（44.500±1.411）%與阿霉素組的凋亡率（35.470±2.139）%相比顯著上升（t=6.104，P=0.0036）。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果

3 討論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個受多因素共同影響的復雜過程，與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡被打破等多種生物過程相關。PTC的發(fā)生和發(fā)展也被證明與基因突變相關[5，6]。原癌基因BRAF在V600E位點的突變是PTC最常見的突變，占29%～83%[5]。BRAF蛋白是生長信號轉(zhuǎn)導蛋白激酶RAF激酶家族的成員，參與調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，促進細胞生長、分化和抗凋亡。BRAFV600E突變已被證明是一種有效的MAPK激活因子，在包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種人類癌癥中均有發(fā)生[7]。多項研究表明，BRAFV600E突變與甲狀腺外擴張、多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期TNM有關[8]，其不僅增加了腫瘤的侵襲性，而且增加了疾病的復發(fā)率和死亡率[9]。這些發(fā)現(xiàn)表明BRAFV600E突變型PTC需要更為前瞻性的手術(shù)治療及更謹慎的后續(xù)觀察治療。

中藥華蟾素具有抗癌、清熱解毒、消腫、止痛、提高機體免疫力等功能，同時可刺激骨髓增生，增強機體對放療、化療的耐受性。中醫(yī)角度解釋其：“味辛、氣涼、微毒，入心、肝、脾、肺四經(jīng)”，具有利尿消腫、清熱解毒、軟堅散結(jié)的功效[10]。一項關于華蟾素聯(lián)合化療治療晚期惡性腫瘤的臨床研究結(jié)果表明，與單純化療相比，華蟾素聯(lián)合治療使治療后骨髓抑制等并發(fā)癥出現(xiàn)的概率顯著降低，臨床效果明顯[11]。本研究中，20nM華蟾素對B-CPAP細胞的侵襲及遷移無顯著影響，且單獨使用華蟾素處理PTC細胞，其細胞活力也無明顯變化；當華蟾素與阿霉素聯(lián)合作用于B-CPAP細胞時，細胞活力與阿霉素單獨處理時相比顯著降低。除細胞活力受到抑制之外，華蟾素與阿霉素聯(lián)合干預對B-CPAP細胞凋亡也具有顯著影響，與阿霉素單獨處理組相比，聯(lián)合干預組的細胞凋亡率顯著上升。以上結(jié)果表明，華蟾素使得B-CPAP細胞在阿霉素的處理下活力降低，凋亡增加，即增加了B-CPAP細胞的化療敏感性。

本研究為中藥華蟾素在BRAFV600E型PTC中的作用情況提供了實驗基礎，但其分子機制仍需進一步的探索，同時，本研究為今后華蟾素在BRAFV600E型PTC的臨床治療中提供了理論支持。