楊凡，朱玲，吳港城，齊希光，張暉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

紫檀芪(pterostilbene，PTS)是一種芪類化合物，主要存在于藍(lán)莓、葡萄等水果中[1]。研究表明，其是白藜蘆醇的甲基化衍生物，具有抗氧化、延緩衰老、降血脂等生物活性[2]。然而紫檀芪在水中的溶解性極差，導(dǎo)致其生物利用率低，在光照條件下容易轉(zhuǎn)變成順式結(jié)構(gòu)而失去活性[3]，因而限制了其在醫(yī)藥、食品及保健品中的應(yīng)用。

以納米輸送系統(tǒng)改善疏水性分子的溶解性和穩(wěn)定性越來(lái)越受歡迎，尤其是利用蛋白質(zhì)作為載體。蛋白質(zhì)來(lái)源廣、成本低，而且具有多個(gè)疏水區(qū)域可以與活性物質(zhì)結(jié)合，可用于穩(wěn)定膠體顆粒或者納米分散體[4]。TAPAL等[5]制備了大豆蛋白-姜黃素復(fù)合物，姜黃素的溶解性以及生物利用率顯著提高。LIU等[6]利用乳清蛋白保護(hù)白藜蘆醇不被降解，提高了白藜蘆醇的穩(wěn)定性。

亞麻籽蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其溶解性和乳化性良好，而且其熱穩(wěn)定性優(yōu)于大豆蛋白、乳清蛋白等[7]，可以作為活性物質(zhì)的載體。但是其在等電點(diǎn)附近以及高鹽條件下不穩(wěn)定，容易聚集。先前的研究表明，蛋白質(zhì)與多糖(如：海藻酸鈉、大豆多糖等)可以通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，從而有效抑制聚集體的產(chǎn)生，提高體系的穩(wěn)定性[8]。

本文利用可溶性大豆多糖制備負(fù)載紫檀芪的亞麻籽蛋白-大豆多糖核殼型納米復(fù)合物，研究顆粒之間的相互作用以及復(fù)合物的穩(wěn)定性，以期開(kāi)發(fā)出用于醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域的紫檀芪納米輸送體系。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

亞麻籽餅粉，寧夏君星坊食品科技有限公司；可溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharide，SSPS)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；紫檀芪(純度≥98%)，北京百靈威科技有限公司；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，均為分析純。

GL-23M冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙翔之離心機(jī)有限公司；LGJ-10E冷凍干燥機(jī)，寧波森茨生物科技有限公司；Nano-ZS粒度電位儀，英國(guó)馬爾文公司；傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；F-7000熒光光譜儀，日本國(guó)立公司；高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽蛋白的提取

亞麻籽蛋白(flaxseed protein isolate，F(xiàn)PI)的提取方法主要參考YANG等[9]的方法：取100 g亞麻籽餅粉，比例1∶5(g∶mL)的比例加入石油醚，除去殘留的亞麻籽油。將除油后的亞麻籽餅粉按比例1∶20(g∶mL)的比例加入去離子水，調(diào)整溶液pH值為9.5，攪拌2 h。然后將溶液在4 ℃，4 000×g的條件下離心20 min，重復(fù)上述步驟3次后合并上清液。調(diào)整上清液的pH值為4.0，離心收集沉淀，將沉淀溶于水并調(diào)整其pH值為7.0。最后將復(fù)溶后的溶液冷凍干燥得到亞麻籽蛋白粉末，并用凱氏定氮法測(cè)其蛋白含量。

1.2.2 納米復(fù)合物的制備

取一定量的亞麻籽蛋白粉末溶于去離子水，配成20 mg/mL的原始蛋白溶液。將5 mg/mL的紫檀芪乙醇溶液按照體積比1∶10逐滴加入亞麻籽蛋白溶液中，避光攪拌3 h。最后將其離心除去游離的紫檀芪得到亞麻籽蛋白-紫檀芪復(fù)合物溶液(flaxseed protein isolate-pterostilbene nanocomplex，F(xiàn)PN)。

將新鮮制備的FPN復(fù)合物溶液與10 mg/mL的SSPS溶液等體積混合，用1 mol/L HCl調(diào)整溶液pH值為2.0～5.0，得到亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖復(fù)合物溶液(flaxseed protein isolate-pterostilbene-soluble soybean polysaccharide nanocomplex，F(xiàn)PSN)，研究pH對(duì)復(fù)合物的影響。將新鮮制備的FPN復(fù)合物溶液與不同質(zhì)量濃度(5～25 mg/mL)的SSPS溶液等體積混合，用1 mol/L HCl調(diào)整溶液pH值為3.5，得到FPSN，研究SSPS濃度對(duì)復(fù)合物的影響[8]。

1.2.3 納米復(fù)合物的表征

將新鮮制備的復(fù)合物溶液用去離子水稀釋到0.1% 以避免多重散射，利用馬爾文激光粒度儀測(cè)定樣品的平均粒徑、電位和多分散性指數(shù)(polydispersion index，PDI)。測(cè)試條件設(shè)置為：固定角度173°，蛋白顆粒折射率1.763，氦氖激光器為633 nm[10]。

1.2.4 包埋率的測(cè)定

根據(jù)LIU等[11]的方法測(cè)定復(fù)合物中結(jié)合的紫檀芪含量。取1 mL樣品加入乙酸乙酯，漩渦振蕩2 min，靜置分層后收集上層液體，重復(fù)萃取3次后合并有機(jī)相。樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用Waters高效液相色譜(UV檢測(cè)器)測(cè)定樣品中紫檀芪的含量。色譜柱為C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為305 nm，流動(dòng)相為55%(體積分?jǐn)?shù))乙腈，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫檀芪含量(Y=168.55X-11.795,R2=0.998 8)。包埋率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.5 熒光光譜分析

將樣品適當(dāng)稀釋，加入不同濃度梯度的紫檀芪乙醇溶液(0～50 μg/mL)，用F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司)測(cè)定樣品的熒光光譜。固定激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，光譜測(cè)定范圍300～450 nm，掃描速度為1 200 nm/min，狹縫寬度5 nm[4]。

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析

將10 mg冷凍干燥后的樣品與1.0 g的溴化鉀混合均勻后壓片，以溴化鉀為空白背景進(jìn)行掃描。波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，最后結(jié)果用Peakfit 4.12 軟件進(jìn)行分析處理[12]。

1.2.7 納米復(fù)合物的穩(wěn)定性分析

調(diào)節(jié)復(fù)合物溶液pH值為2.0～8.0，以粒徑和電位分析樣品在不同pH條件下的穩(wěn)定性。類似地，在紫檀芪納米復(fù)合物溶液中加入NaCl，使其鹽離子濃度為0～500 mmol/L，通過(guò)電位來(lái)分析樣品在不同鹽離子條件下的穩(wěn)定性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，并用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米復(fù)合物制備參數(shù)的研究

2.1.1 pH對(duì)復(fù)合物包埋效果的影響

亞麻籽蛋白的等電點(diǎn)為4～5[13]，pH<4時(shí)，亞麻籽蛋白帶正電，大豆多糖帶負(fù)電，二者可以通過(guò)靜電相互作用形成核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒[8]。如圖1所示，pH=2時(shí)，納米顆粒的包埋率最小，僅為70.12%，其Zeta 電位大約為-19.3 mV，此時(shí)顆粒間的靜電排斥作用弱，容易聚集沉淀，導(dǎo)致離心后上清液中的紫檀芪含量變少，因而其包埋率最小。pH=3.5時(shí)，包埋率達(dá)到95.06%，在該條件下，亞麻籽蛋白與大豆多糖帶相反電荷，有助于二者之間的相互作用，此時(shí)整個(gè)體系分散均勻，因此選擇pH=3.5來(lái)制備納米復(fù)合物。

A-粒徑與PDI；B-包埋率圖1 pH對(duì)FPSN粒徑、PDI和包埋率的影響Fig.1 Effect of pH on the particle diameter, PDI and encapsulation efficiency of FPSN

2.1.2 多糖質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物包埋效果的影響

如圖2所示，未添加大豆多糖時(shí)，復(fù)合物帶正電荷。隨著大豆多糖的加入，復(fù)合物表面吸附的大豆多糖逐漸增加，納米顆粒平均粒徑逐漸增大，復(fù)合物表面的凈電荷增加，使得顆粒之間的靜電斥力變大。質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL后，電位趨于穩(wěn)定，且其電位值與大豆多糖在pH=3.5時(shí)的電位值相似，表明大豆多糖纏繞在了亞麻籽蛋白的表面，其靜電斥力阻止了顆粒間的聚集。大豆多糖質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)使顆粒粒徑變大，體系分散不均勻，因此選擇10 mg/mL作為最佳濃度，此時(shí)復(fù)合物表面的大豆多糖也達(dá)到飽和，分散液也比較穩(wěn)定。

A-粒徑和PDI；B-Zeta電位圖2 大豆多糖質(zhì)量濃度對(duì)FPSN電位、粒徑和PDI的影響Fig.2 Effect of SSPS concentration on the zeta potential, particle diameter and PDI of FPSN

2.2 顆粒間的相互作用分析

2.2.1 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基具有熒光，可在280 nm波長(zhǎng)處被激發(fā)，而且這些氨基酸殘基對(duì)微環(huán)境的變化很敏感，因此可以利用熒光光譜法來(lái)研究疏水性生物活性分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用[14]。如圖3所示，在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，亞麻籽蛋白在350 nm處出現(xiàn)了峰值。隨著紫檀芪濃度的增加，亞麻籽蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸變小，說(shuō)明紫檀芪的加入使得亞麻籽蛋白發(fā)生了熒光猝滅。還可以看到亞麻籽蛋白的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移現(xiàn)象(350～357 nm)，表明色氨酸進(jìn)入了一個(gè)更加親水的微環(huán)境，同時(shí)也可以得出紫檀芪與亞麻籽蛋白之間存在疏水相互作用的結(jié)論。CHEN等[15]通過(guò)將大豆蛋白與百里酚結(jié)合來(lái)改善百里酚的穩(wěn)定性，百里酚對(duì)大豆蛋白有熒光猝滅效應(yīng)，二者之間存在疏水相互作用。

圖3 紫檀芪對(duì)亞麻籽蛋白內(nèi)源熒光猝滅情況Fig.3 Typical profiles for the quenching of intrinsic fluorescence of FPI, by increasing concentrations of PTS

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析

A-PTS；B-SSPS、FPI、FPN、FPSN圖4 PTS、FPI、SSPS、FPN、FPSN的紅外光光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PTS, FPI, SSPS, FPN and FPSN

2.3 穩(wěn)定性分析

2.3.1 pH穩(wěn)定性

Zeta電位是表征膠體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。其絕對(duì)值越大，表明顆粒間的斥力越大，整個(gè)體系越穩(wěn)定。相反，其絕對(duì)值越小，體系越不穩(wěn)定，容易聚集沉淀[18]。納米顆粒表面的Zeta電位隨pH的變化如圖5所示，由于大豆多糖的存在，F(xiàn)PSN的帶電量高于FPN。在中性條件下，由FPN和FPSN均帶負(fù)電，隨著pH的降低，復(fù)合物的|Zeta|逐漸變小。FPN在pH=4～5時(shí)凈電荷為0，隨著pH的進(jìn)一步降低，Zeta 電位變?yōu)檎移渲抵饾u變大。

由圖5可知， pH=4、5時(shí)，F(xiàn)PN的平均粒徑明顯高于其他pH條件下的粒徑。這是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，F(xiàn)PI所帶凈電荷幾乎為0，顆粒間的斥力較小，體系不穩(wěn)定，導(dǎo)致其粒徑比較大。pH=2時(shí)，F(xiàn)PSN復(fù)合物體系穩(wěn)定性較差，相互作用較弱，容易聚集。隨著pH的增大，F(xiàn)PSN的平均粒徑保持在250 nm左右，其溶解度提高，沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明大豆多糖的加入有效提高了復(fù)合物的穩(wěn)定性。大豆多糖之所以能夠改善蛋白在酸性條件下的穩(wěn)定性，是因?yàn)榇蠖苟嗵怯袕?fù)雜的多糖鏈，可以纏繞在蛋白表面，通過(guò)空間位阻效應(yīng)以及靜電排斥力阻止蛋白的聚集。

A-Zeta電位；B-平均粒徑圖5 pH對(duì)FPN和FPSN納米復(fù)合物的影響Fig.5 Effect of pH value on FPN and FPSN nanocomplex

2.3.2 鹽離子穩(wěn)定性

蛋白基納米顆粒對(duì)鹽離子的穩(wěn)定性較差，因此有必要研究鹽離子對(duì)所制備復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。由圖6可知，2種復(fù)合物電位隨著鹽離子濃度的變化趨勢(shì)是相似的，隨著鹽濃度的增大，顆粒表面的凈電荷減少，其電位值變小，原因可能是鹽離子屏蔽了蛋白表面的電荷，從而削弱了亞麻籽蛋白與大豆多糖之間的相互作用，導(dǎo)致顆粒的聚集。盡管鹽離子降低了FPSN的表面電荷，但其帶電量仍然高于FPN。FPSN表面的大豆多糖為納米粒子提供了空間位阻，可以使納米粒子在高離子強(qiáng)度下保持穩(wěn)定[19]。LI等[20]制備了大豆蛋白-二十八烷醇納米復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物的 Zeta電位也隨著鹽離子濃度的增加而降低。

A-FPN；B-FPSN圖6 鹽離子濃度對(duì)FPN和FPSN納米復(fù)合物Zeta電位的影響Fig.6 Effect of ion concentration on zeta potential of FPN and FPSN nanocomplex

3 結(jié)論

本研究制備了亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖納米復(fù)合物來(lái)改善紫檀芪的水溶性及穩(wěn)定性。溶液pH值為3.5且大豆多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，包埋率達(dá)到95.06%，此時(shí)整個(gè)體系分散比較均勻。通過(guò)熒光光譜和傅里葉紅外光譜發(fā)現(xiàn)，亞麻籽蛋白、大豆多糖、紫檀芪在形成復(fù)合物時(shí)存在相互作用，主要為疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵作用力。加入大豆多糖后，納米復(fù)合物在酸性條件和高鹽條件下的穩(wěn)定性得到明顯改善。本研究制備的亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖納米復(fù)合物具有應(yīng)用于醫(yī)藥、功能性食品的潛力。