李祥 程婷 汪瀚 汪美霞 楊文明 胡建鵬

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

3.新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038

4.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012

肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson disease，WD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)常染色體隱性遺傳病，主要病理特點為銅代謝異常，是全球為數(shù)不多的能夠進(jìn)行有效診治的遺傳疾病。在骨骼、肝、角膜、心臟、腦及腎等組織器官內(nèi)會積聚過多的銅，產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)損傷、肝硬化、角膜K-F環(huán)、心功能損傷、椎體外系癥狀等臨床表現(xiàn)[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對WD的肝臟、大腦等臟器和組織受損的病因病理、臨床研究關(guān)注頗高，有研究顯示W(wǎng)D骨骼肌病變誤診率高達(dá)10 %，占比超過該病總誤診率的1/4，常因誤診誤治加重病情[2]。有關(guān)文獻(xiàn)顯示W(wǎng)D骨關(guān)節(jié)損害的發(fā)生率為18 %～80 %不等，表明WD的骨關(guān)節(jié)損害并非罕見，臨床上應(yīng)重視該病的骨代謝障礙癥狀。相關(guān)專家將文獻(xiàn)資料歸納總結(jié)后得出WD患者廣泛存在骨關(guān)節(jié)損傷，都有一定程度骨質(zhì)疏松、骨密度下降等變化，容易導(dǎo)致軟骨炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)碎片化、關(guān)節(jié)鈣化灶、局限性脫礦物質(zhì)、骨畸形、骨折等[3-4]。本團隊前期大量的臨床和基礎(chǔ)研究顯示肝豆靈片可以有效改善肝豆?fàn)詈俗冃圆∏?，且不良反?yīng)較小?，F(xiàn)觀察比較肝豆靈片治療WD骨代謝障礙患者前后臨床癥狀、細(xì)胞因子及骨代謝生化指標(biāo)的變化，探討肝豆靈片療效和WD骨代謝障礙可能機制，為本病診斷和治療提供一定借鑒。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2018年3月至2018年10月入住我院腦病三科符合WD納入標(biāo)準(zhǔn)的44例患者病例資料，男11例，女23例，年齡10～40歲，平均(21.5±8.0)歲；病程6～360個月，平均(82.1±80.8)個月。44例WD患者中15例出現(xiàn)了腕、踝、膝、髖關(guān)節(jié)程度不一的疼痛；6例伴發(fā)不同程度的關(guān)節(jié)畸形，以雙下肢、雙前臂遠(yuǎn)端或末端明顯，日常活動較受限；10例患者常常自覺雙前臂、雙下肢乏力明顯；13例患者無明顯骨代謝障礙不適癥狀。另有30例體健的志愿人員加入本研究(健康組)，有12例男性，18例女性，平均年齡為(24.0±7.1)歲。在年齡及性別等層面，治療組與健康組沒有明顯差別，可以進(jìn)行對比。在整個研究中沒有一個受試者中途脫落，入組的全部病例都順利完成治療。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)與中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1WD西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①有肝病病史或椎體外系病史，或者同時具有以上兩種病史；②血清銅藍(lán)蛋白明顯下降；③眼科會診提示角膜K-F環(huán)(+)；④親屬患有或曾患有WD，有家族史。①、②為確診的必備條件，再加上③、④中任何一條就可確診。

1.2.2骨代謝障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)(Z值)[6]：①骨量低：Z小于-2；②骨量減少：骨密度值下降1至2.5個標(biāo)準(zhǔn)差；③骨質(zhì)疏松：骨密度至少下降2.5個標(biāo)準(zhǔn)差；④嚴(yán)重骨質(zhì)疏松：除了滿足第③外，還需伴有至少一處骨折。以上骨密度值均與同性別且同種族的正常成人骨峰值比較，出現(xiàn)以上任一征象者示為異常。

1.2.3WD中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：當(dāng)痰瘀互結(jié)證與肝腎虧虛證二者的中醫(yī)證候積分值≥20分時，可以確診[8]。

1.2.4納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)西醫(yī)診斷，確診為WD及骨代謝障礙；②經(jīng)中醫(yī)診斷，確診為肝腎虧虛型或痰瘀互結(jié)型；③年齡10～40歲(不包括10歲和40歲)；④通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，受試者或監(jiān)護(hù)人自愿簽署知情同意書；⑤就醫(yī)前2周沒有進(jìn)行任何專業(yè)系統(tǒng)的驅(qū)銅治療，同時未有其他影響骨代謝的疾病服藥史，未有骨質(zhì)疏松、骨折等病史。

1.2.5排除、脫落標(biāo)準(zhǔn)：①年齡小于等于10歲或大于等于40歲；②就診前2周已使用明確影響代謝的藥物；③沒有依據(jù)規(guī)定診治沒有辦法判定治療效果的患者；沒有按時定期隨訪者。在分析病例時將脫落病例剔除，不進(jìn)行分析。

1.3 治療方法

1.3.1入組44例患者及30例體健的志愿人員均于入組次日早晨空腹采靜脈血6 mL，經(jīng)離心機(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司，型號：精達(dá)80-2)離心(3 500 r/min，15 min)后，取上層血清3 mL置于-20 ℃冰箱中保存。采集后進(jìn)行血清銅、銅藍(lán)蛋白、銅氧化酶、生化、UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、雙能X骨密度(含雙前臂、雙股骨、腰椎L1-L4)測定，骨轉(zhuǎn)化生化標(biāo)志物及細(xì)胞因子指標(biāo)檢測。另囑患者入院次日早晨7時排空尿液，留取24 h尿液并記錄總量，取5 mL檢測，4個治療周期后復(fù)查24 h尿銅。

1.3.244例患者均在入院后進(jìn)行中醫(yī)望、聞、問、切，詳細(xì)采集患者癥狀、體征、舌苔、脈象，按照診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行辨證分型、臨床分型。①基礎(chǔ)治療：DMPS 20 mg/(kg·d)(規(guī)格0.125 g/2 mL，批號：120903，上海禾豐制藥有限公司)溶于5 %葡萄糖注射液250 mL緩慢靜滴 qd，連續(xù)6 d為1個療程，每個療程之間間隔2 d。同一時間口服1# qd、4個療程的鈣爾奇碳酸鈣D3片(江蘇惠氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H10950029，規(guī)格：每片包含600 mg的鈣與125 IU的維生素D3)。②肝豆靈組：在基礎(chǔ)治療的同時服用肝豆靈(安徽省中醫(yī)院制劑中心提供，經(jīng)該院主管藥師萇鳳錦鑒定為正品，由大黃、丹參、莪術(shù)、金錢草等組成)，早晚各150 m L溫服，連續(xù)4個療程。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

觀察治療前后血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1，比較治療前后24 h尿銅、UWDRS評分、中醫(yī)證候積分，觀察不良反應(yīng)等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 健康受試者與 WD骨代謝障礙患者骨代謝、細(xì)胞因子指標(biāo)比較

健康受試者與WD骨代謝障礙患者血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1比較。見表1。

表1 健康受試者與 WD骨代謝障礙患者骨代謝、細(xì)胞因子指標(biāo)比較

根據(jù)表1可以看出：WD組病患的IGF-1、IL-10、1,25-(OH)2D3及血Ca水平比健康組顯著減少，且兩組程度比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 WD骨代謝障礙患者兩組治療前后骨代謝生化指標(biāo)、細(xì)胞因子指標(biāo)變化

WD骨代謝障礙患者兩組治療前后骨代謝生化指標(biāo)、細(xì)胞因子指標(biāo)變化，見表2。

表2 兩組治療前后骨代謝生化指標(biāo)、細(xì)胞因子指標(biāo)變化

表2數(shù)據(jù)提示，兩組組內(nèi)進(jìn)行對比，對照組在治療后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1水平與治療前相比顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IL-4與治療前相比減少并差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BGP、BAP、TNF-α與診治前相比均減少，IL-10與診治前相比有所升高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝豆靈組療后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1較療前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均較療前降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IL-10較療前升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組療后比較，肝豆靈組血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1、IL-4、BGP、BAP、TNF-α變化均較對照組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 WD骨代謝障礙患者兩組治療前后UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、尿銅值比較

WD骨代謝障礙患者兩組治療前后UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、尿銅值比較，見表3～表5。

表3 兩組UWDRS分值變化分)

表4 兩組中醫(yī)證候積分變化分)

表5 兩組24 h尿銅變化

表3數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的UWDRS分?jǐn)?shù)均小于診治前，變化程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，肝豆靈組UWDRS分?jǐn)?shù)與對照組進(jìn)行比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的中醫(yī)證候分?jǐn)?shù)和診治前相比均有減少，變化程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，肝豆靈組中醫(yī)證候積分與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表5數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的24 h尿銅值和診治前相比均有減少，變化程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，肝豆靈組24 h尿銅值與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 WD骨代謝障礙患者兩組治療期間不良反應(yīng)的觀察

WD骨代謝障礙患者兩組治療期間的不良反應(yīng)，見表6。

表6 兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較(n)

表6顯示，兩組治療過程中均有不良反應(yīng)出現(xiàn)，以低熱、皮疹出現(xiàn)比例最高，肝豆靈組不良反應(yīng)發(fā)生率(11.11 %)明顯低于對照組(23.07 %)。

3 討論

綜合文獻(xiàn)分析得出骨質(zhì)疏松癥、佝僂病、早期骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)軟化、骨畸形等是WD骨代謝障礙的常見特征，但目前臨床上這種臨床表現(xiàn)很少引起醫(yī)生重視，誤診率較高。2009年WD全球評估量表，把骨骼和肌肉損傷表現(xiàn)列為診斷WD四個主要癥狀群之一[9]。Bhatnagar等[10]報告一位患有股骨頸病理性骨折3個月的12歲女孩，后診斷為WD。因此如果兒童或青少年出現(xiàn)無法解釋的肌肉骨骼問題，應(yīng)考慮該病。骨密度約反映骨強度的70 %，WD其生物化學(xué)特征是各種組織器官中細(xì)胞內(nèi)銅濃度的增加，WD合并骨質(zhì)疏松的特征是骨密度減低、微結(jié)構(gòu)退化和骨折風(fēng)險增加。WD骨代謝障礙患者如果長期得不到正確診治，可引起骨骼肌肉系統(tǒng)的不可逆損傷，對患者造成肢體功能殘障等嚴(yán)重不良后果，因此對于WD合并骨代謝障礙早期診斷并予以有效治療尤為關(guān)鍵和必要，有利于防止進(jìn)一步的功能障礙。

人體vitD2、vitD3 在體內(nèi)氧化形成25-(OH)D3后變化成具有完全活性的1,25-(OH)2D3。本研究發(fā)現(xiàn)WD患者血Ca和1,25-(OH)2D3較健康組明顯減低，推測很大程度上由于體內(nèi)的羥化酶活性降低導(dǎo)致WD患者1,25-(OH)2D3合成不足。WD中的游離銅毒性較大，可能增加氧化應(yīng)激標(biāo)志物的應(yīng)激性增高，產(chǎn)生細(xì)胞組織器官的毒性損傷，氧化應(yīng)激的增加可能會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子在死亡信號的級聯(lián)傳導(dǎo)活動[11]。IL-4主要由活化的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞產(chǎn)生，可通過抑制OC前體轉(zhuǎn)化為OC，從而發(fā)揮抑制骨破壞作用。IL-10作為細(xì)胞因子中的干擾素家族功能比較多的一類負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可以明顯地抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-2等，能夠明顯減少破骨細(xì)胞的聚合性以及活化程度。TNF-α的生物活性十分活躍，在某角度上可以加快骨吸收，加快骨相關(guān)細(xì)胞凋亡速度。骨堿性磷酸酶(BAP)、骨羧基谷氨酸蛋白(BGP)直接反映骨密度、微結(jié)構(gòu)退化程度。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)作為活性蛋白多肽物質(zhì)，有著加快骨的合成代謝，確保體內(nèi)正常結(jié)構(gòu)功能不受到影響的作用，增大成骨細(xì)胞的堿性磷酸酯酶的活性程度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)WD骨代謝障礙患者骨密度異常，臨床骨關(guān)節(jié)損害表現(xiàn)不一，其血清BGP、BAP、IL-4、TNF-α水平升高，IL-10、IGF-1水平降低。通過肝豆靈片治療后上述骨代謝指標(biāo)和細(xì)胞炎性因子均有變化，其中血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1較治療前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均較治療前降低，表明肝豆靈片可影響肝豆?fàn)詈俗冃曰颊唧w內(nèi)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)。

肝豆靈是依據(jù)新安醫(yī)學(xué)腦病方面特有的中藥方劑理論和特色，創(chuàng)制的特色院內(nèi)制劑。方中郁金芳香疏肝、解郁化濁、清心涼血；姜黃活血行氣；黃連清濕熱；莪術(shù)活血行氣；丹參、雞血藤活血養(yǎng)血，通經(jīng)利絡(luò)；大黃清熱解毒、通腑利濕；諸藥合理搭配，共奏活血化瘀、疏肝利膽、祛痰排銅之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)郁金具有抗炎止痛，減輕炎性反應(yīng)的作用[13]；姜黃具有抑制腎組織氧化損傷，保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)的作用[14]；莪術(shù)能抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，降低尿酸、尿素等，減輕腎組織的纖維化進(jìn)展程[15-16]；丹參酮ⅡA能抑制腎氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩腎組織損傷作用[17]；金錢草是保護(hù)治療腎臟疾病的重要中藥之一，具有降低血尿素和多種氨基酸的含量, 逆轉(zhuǎn)部分腎損傷潛在標(biāo)志物的相對含量，可能與金錢草總黃酮抑制腎損傷氧化應(yīng)激和抑制骨橋蛋白的表達(dá)有關(guān)[18]；澤瀉能抑制腎小球損傷，減輕腎小管變性，抑制腎炎、腎病綜合征等并發(fā)癥的發(fā)生[19]。

肝豆?fàn)詈俗冃詫儆谶z傳性疾病，中醫(yī)認(rèn)為遺傳性疾病本質(zhì)是先天腎精不足，腎的“藏精，主生長、發(fā)育、生殖”功能受損。WD病機是先天腎精不足，加上銅毒侵襲，導(dǎo)致肝、脾等臟器受損，最終表現(xiàn)為肝、脾、腎俱虛的臨床癥狀[20]。本研究提示肝豆靈片能夠?qū)Ω味範(fàn)詈俗冃怨谴x障礙具有調(diào)節(jié)的作用，經(jīng)過對細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，從而對肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩墓谴x受損有著治療效果，可以在臨床中推廣使用。