趙洺良 王明剛 劉振玉 孫桂玉 王清亭 杜昌余 陳陽生

正大制藥(青島)有限公司，山東 青島 266510

人類皮膚中的UV-B(290～315 nm)依賴性非酶反應將膽固醇前體7-脫氫膽固醇轉變?yōu)榫S生素原D3，維生素原D3進一步異構化為維生素D3(圖1 A)[1]。 同樣，經紫外線B輻射的植物和蘑菇也能夠使膜固醇麥角固醇生成異構化的維生素D2(圖1B)[2]。兩種類固醇本身都是生物惰性的，須使其C-25處被活化，然后羥基化生成25(OH)D3(圖1C)和25(OH)D2，最后在C-1處羥基化，分別生成1,25(OH)2D3(圖1D)[3]和1, 25(OH)2D2。見圖1。

圖1 維生素D代謝產物和部分已上市維生素D類似物

25(OH)D3是最穩(wěn)定和最豐富的維生素D代謝產物，其血清水平是測定個體維生素D水平的生物標志物[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，維生素D3的生物活性形式1,25(OH)2D3通過激活轉錄因子維生素D受體(VDR)作為直接影響基因調控的核激素而起作用。維生素D的生理作用首先是調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)以維持骨骼鈣化[6]，同時還可以通過調控先天和適應性免疫來調節(jié)機體對微生物感染的應激反應水平[7]，比如在人體對結核分枝桿菌的應激反應應答中，維生素D起到至關重要的作用[8]。最后，維生素D還可以預防自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化等[9]。

隨著社會生活水平的不斷提高，現(xiàn)代人類的生活方式改變(例如主要呆在室內，并在戶外被紡織品衣物覆蓋，以及使用各類防曬用品)，再加上季節(jié)和氣候的變化，導致了人體對紫外線中的UV-B暴露不足，維生素D3的內源性生產水平有所降低。目前，人類食譜中僅富含脂肪的魚類和經過UV-B照射的蘑菇具有較高含量的維生素D3或維生素D2，這導致了日常飲食中維生素D的攝入量普遍較低。因此，在某些國家/地區(qū)使用添加了維生素D3或維生素D2的牛奶、人造黃油和果汁作為維生素D補充劑。此外，有文獻[10]建議在冬季，尤其是中老年人和兒童，每天至少補充25 μg(1 000 IU)的維生素D3，以防止維生素D缺乏癥。維生素D缺乏不僅會導致某些兒童疾病(如佝僂病)，而且還會導致成年人罹患骨質疏松癥或骨軟化癥[11],從而增加骨折的風險。此外，維生素D缺乏還會損害免疫系統(tǒng)的功能。近年來，普通人群對于維生素D補充劑的需求量明顯增加，維生素D補充產品的銷售額在10年內增長了近15倍[12]。

毫無疑問，補充足夠的維生素D對于骨骼健康很重要[13]，但是過量服用維生素D3、1,25(OH)2D3或其合成類似物可能會導致組織鈣化[14]，并產生高血鈣癥。因此，目前開發(fā)維生素D類似物的主要目的是通過結構修飾，降低化合物的鈣化作用，提高選擇性。近幾十年來，各大制藥公司和科研團隊總共開發(fā)了3 000多種合成維生素D類似物，以提高原天然化合物的生物學特性，并期望用于治療皮膚自身免疫性疾病[15]或骨代謝疾病[16]。然而，到目前為止，只有少數(shù)維生素D類化合物進入市場(圖1)。除了維生素D3被廣泛用作營養(yǎng)補充劑之外，商業(yè)上比較成功的維生素D類似物有卡泊三醇(圖1E)、度骨化醇(圖1F)、阿法骨化醇(圖1G)、他骨化醇(圖1H)、帕立骨化醇(圖1I)、奧沙鈣醇(圖1 J)、氟骨化醇(圖1 K)和艾地骨化醇(圖1 L)[17-18]。維生素D3類似物如依奈骨化醇(圖1 M)或西奧骨化醇(圖1 N)，雖然在體外表現(xiàn)出了很強的抗腫瘤活性，但是在急性髓樣白血病或胰腺癌的II期臨床試驗中均宣告失敗[19]?？蒲腥藛T在研究[20-21]中發(fā)現(xiàn)，一些維生素D靶基因與免疫系統(tǒng)密切相關，例如抗菌肽(cathelicidin,CAMP)和編碼Toll樣受體4核心受體(CD14)，對該類化合物具有較強的應答。該類藥物或化合物在抗癌試驗中失敗，但在骨代謝疾病治療中成功，以及在免疫細胞中存在顯著的基因調節(jié)作用。這些結果表明，作為VDR配體的維生素D類化合物及其衍生物在骨代謝相關功能調節(jié)以及免疫疾病中比在癌癥中更加具有治療潛力，這也為該類藥物的臨床應用指明了方向。

1 維生素D藥物作用機理

人類基因組中,維生素D受體(VDR)是唯一被表達的且能夠在亞納摩爾濃度下結合1,25(OH)2D3及其類似物的蛋白質[22]，因此，維生素D類化合物的所有生理功能都是由VDR及其靶基因介導的[23]。VDR基因不僅在腸、腎和骨骼中表達水平較高，同時在其他多種人類組織和細胞類型中，也發(fā)現(xiàn)了VDR的表達[24]。這意味著與鈣穩(wěn)態(tài)和骨骼形成有關的組織細胞與具有免疫功能的細胞對環(huán)境維生素D的水平都有應答作用[25]，從分子水平證實了維生素D類藥物對骨代謝以及免疫疾病具有治療作用。

進一步的研究[26]發(fā)現(xiàn)，VDR配體誘導了LBD的構象轉變，LBD共抑制蛋白被共激活蛋白替代，這說明，VDR配體結合誘導了受體不同的蛋白質與蛋白質的相互作用模式。VDR激動劑可有效抑制LBD上的共阻遏物，并允許共激活因子與介體復合物特異性結合(圖2)。共激活因子還吸引染色質修飾酶，這些酶在組蛋白VDR結合位點附近參與核小體組蛋白的讀取以及轉錄[27]。此外，染色質重塑復合物的表觀遺傳學變化允許VDR結合增強子向整個人類基因組中數(shù)百至數(shù)千個基因上可及的轉錄起始位點(TSSs)循環(huán)[28- 29]。這些增強子TSSs組裝體由配體激活的VDR觸發(fā)，最終可導致數(shù)百種主要的維生素D靶基因的表達增加或減少(圖2)。目前為止，有文獻[30]報道了約150種包括人、大鼠和斑馬魚VDR-LBD結構的蛋白質結晶。由于每種維生素D類似物的三個羥基基團占據(jù)幾乎相同的位置，因此通過將LBD穩(wěn)定在大致相同的構象中，維生素D類藥物的空間表現(xiàn)均類似于1,25(OH)2D3。

圖2 維生素D信號通路[26]

對維生素D類似物進行化學修飾的主要目的是將三個錨定的羥基與1,25(OH)2D3保持在相同的位置，可以最有效地填充LBP，以保證足夠的氫鍵或疏水性接觸。此外，從頭設計的帶有修飾的非甾族化合物，例如通過具有芳香性的環(huán)交換經典的甾族環(huán)結構也被合成出來。研究這些分子的目的，是為了保留LBP內表面襯里的氨基酸殘基的疏水相互作用，以及增加與芳族氨基酸殘基的堆積相互作用。本文同樣探討了這些不同種類的維生素D類似物的研究進展。

2 側鏈修飾

Mourino等[31]報道了一系列具有剛性側鏈的維生素D類似物(圖3 A-3D)，該類化合物是以Inhoffen-Lythgoe二醇為原料，通過Wittig-Horner反應聚合而成的。生物活性實驗結果表明，與1,25(OH)2D3相比，這些類似物使得VDR依賴性轉錄被顯著激活。最新的研究結果[32]表明, C-22位獨特的二炔類似物結構修飾以及通過乙烯基(pinacolo)硼酸酯方法獲得的C-17位甲基取代類似物，前者在激活VDR方面的效力較低,后者比1,25(OH)2D3更有效地結合VDR。

1,25cD3(圖3E)是一種新穎的維生素D類似物，其中鄰-碳硼烷部分取代了C-25羥基[33]。盡管不含C-25羥基，但是1,25cD3對VDR的親和力是1,25(OH)2D3的2倍，并且在誘導靶基因活性方面與天然激素維生素D3具有同等活性，同時未顯示出不良的降鈣作用。此外，與大多數(shù)其他維生素D類似物一樣，1,2,5cD3與VDR的LBD的復合物的構象與1,25(OH)2D3的構象高度相似，蛋白質三維模型也顯示出相同的拓撲結構。對該蛋白結合域分析結果表明，螺旋H6和H7之間的環(huán)是受體激活的關鍵區(qū)域，螺旋H11的最后一部分顯示了0.6的偏移；碳硼烷側鏈比1,25(OH)2D3長2.4?，但是它是疏水的，因此在VDR-LBP的這一部分中有利于與疏水氨基酸的相互作用。這一定程度上補償了C-25羥基基團缺失造成的氫鍵損失(圖4 A, 圖4B)。這些影響在整體上使得1,25cD3化合物的VDR-LBD具有更高穩(wěn)定性。這一報道也使得C-25羥基在結構中的重要性有所降低。

圖3 側鏈與A環(huán)分別修飾維生素D類似物

圖4 維生素D類似物與VDR的結合[33]

3 側鏈以及A環(huán)的共修飾

Yamamoto等[34]成功合成了一系列含有或不含有C-22S烷基取代基的維生素D類似物及C-22S烷基衍生物，并進行了生物活性研究(圖5)。與僅進行側鏈修飾的維生素D類似物相比，該類衍生物的VDR結合親和力相對25(OH)2D3降低了10倍。構效關系研究結果[35]表明，化合物中C-22取代基體積的增加導致VDR結合親和力降低。具有正常側鏈的化合物在對靶基因檢測中顯示出很強的活性，而沒有C-22取代的化合物 (圖5 Aa, Ba, Ca, Da)甚至具有完全的激動劑活性。相反，C-22S丁基取代的分子(圖5 Ac, Bc, Cc, Dc)由于體積增加，幾乎沒有激活能力，而C-22S乙基取代的化合物 (圖5 Ab, Bb, Cb, Db)則具有中等活性。此外，類似物Aa, Ba, Ca,和Da以濃度依賴的方式誘導VDR伴侶受體、黃醇X受體(RXR，圖2)和共激活肽的富集，而C-22S取代的化合物僅引起中等效應[36]。這一系列實驗結果證實了側鏈的長度與體積對維生素D類化合物的VDR活性具有至關重要的影響。

與其他C-22S 1,25(OH)2D3衍生物(圖5 E-H)[37]絡合的VDR-LBD晶體結構初步證實了這些化合物通過將氨基酸L305旋轉約305°C，觸發(fā)LBP的額外腔向外延申約27°，以遮蓋側鏈丁基(圖4C)。當配體不與受體的C末端螺旋H12相互作用時，這些化合物(配體)充當VDR拮抗劑。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，由于共激活肽的存在，螺旋H12的位置始終保持在激動位置，但是多個殘基從22-丁基旁由于擠壓移開或旋轉。這些變化會削弱與H301(螺旋H6 / 7)、H393(H11)或F418(H12)的相互作用，并使LBD的該結構區(qū)域不穩(wěn)定(圖4C)。研究[38]還發(fā)現(xiàn)，存在共激活肽的情況下，某些拮抗的22-丁基類似物具有激動性構象。這些結晶的人工蛋白復合物還可能具有一定的生理意義，例如在細胞環(huán)境中感測輔因子平衡情況，具有進一步開發(fā)的前景。

為了評估C-22上的甲基對化合物生物活性的影響，近年來，DeLuca等[39]采用Wittig-Horner反應制備了化合物E的多種新衍生物(圖5)。與原化合物E相比，(20R)-25-羥基化側鏈(J)的單甲基化不會改變VDR結合親和力。但是在(20S)-25-羥基化的基礎上增加了22-甲基側鏈(K)使得化合物產生了更強的活性，VDR親和力增強[40]。 22R化合物Ka的VDR結合親和力是維生素D3的2.5倍，效力是22-epimer的250倍[41]。在“天然”側鏈(20R)(Ia)中具有22S-甲基類似物的生物活性比化合物(Ib)高10倍，而在“非天然”情況下(20S)，化合物Ja比化合物E的效力高4倍。當在C-22處引入兩個甲基時，例如20R-化合物(Ka)和20S化合物(Kb)，其VDR結合親和力與1,25(OH)2D3相比得到增加，但是增幅不大[42]。這說明C-22上的甲基的立體構型對化合物的親和力有顯著影響，這與其在LBD中的相對位置有很大關系。

圖5 維生素D類似物

4 非甾體VDR配體

通過雙分子親核取代[43]可以合成包含疏水性單元的非甾體VDR激動劑[44](圖5)。利用碳硼烷的疏水性，碳硼烷籠取代了天然維生素D的CD環(huán)。盡管其結構簡單靈活，但與1,25(OH)2D3相比，基于碳硼烷的VDR配體對VDR只表現(xiàn)出中等的結合親和力。這些類似物是柔性的無環(huán)三元醇，缺乏A環(huán)和共軛三烯結構，它們的結構在碳硼烷碳上共享一條支鏈側鏈，而在另一碳上，分別與L、M或N三種不同的鏈結合。二醇的柔韌性有利于提高與VDR結合的親和力，但仍然比1,25(OH)2D3低100多倍。不過，這些化合物在誘導HL-60細胞分化方面具有較強活性[45-46]。

5 總結

綜上所述，化學合成方法和手段的豐富大大增加了藥物化學家們合成維生素D類似物的數(shù)量和種類。目前對于不含25-羥基的功能分子，例如鄰-碳烷化合物的合成和活性研究工作仍在繼續(xù)。 此外，現(xiàn)在有一些完全缺乏A環(huán)或CD環(huán)的分子，例如非甾體類維生素D類似物，仍可以與VDR相互作用，但目前報道較少。這些非甾體類維生素D類似物，有些在體外具有高活性，并且在體內具有降低血鈣的作用。因此，預計未來非甾體維生素D類似物的報道將進一步增加。

對VDR配體，即維生素D類似物的生物學特征的評估，仍然主要為體外活性實驗，例如VDR親和力實驗、靶基因結合測定以及不同癌細胞系中抗增殖和分化程度的測定。測定方法的多樣性使得活性數(shù)據(jù)難以一致，缺乏具體的量化標準，無法直接比較不同類型的維生素D類似物。而且，如果不改變檢測方法(例如分離新鮮的人外周血單核細胞中的基因表達譜)，就不可能準確的推斷化合物的體內活性情況[47]。這對該類化合物的進一步優(yōu)化和應用產生了不利影響。

近年來，關于維生素D類似物的研究幾乎僅在少數(shù)科研機構中進行，許多引人關注的VDR配體結構優(yōu)化方法并未最大限度地被挖掘出來。隨著近150個VDR-LBD晶體結構的解析，以及越來越多蛋白質結晶結構解析的出現(xiàn)，顯示出科研人員對了解VDR激動劑和拮抗劑的分子相互作用有著非常積極的興趣，有進一步深入研究的可能。

然而，令人遺憾的是，針對癌癥的臨床試驗失敗仍然極大地削弱了制藥企業(yè)對進一步開發(fā)維生素D化合物的興趣。由于天然激素1,25(OH)2D3主要預防與骨骼和免疫系統(tǒng)有關的疾病，因此該分子及其合成衍生物可能不是治療癌癥的理想藥物。然而已有文獻[48-49]報道顯示人胰腺腫瘤基質中卡泊三醇活化的VDR可以顯著減少胰腺炎和人腫瘤基質中炎癥和纖維化的標志物表達水平。這表明維生素D化合物可能對腫瘤微環(huán)境的免疫細胞造成一定影響，而不是直接抑制腫瘤微環(huán)境下的癌細胞的增殖，這說明該類藥物的抗腫瘤作用機理還需進一步發(fā)掘。實際上，迄今為止，有關VDR及其配體作用的全基因組數(shù)據(jù)大部分可從造血系統(tǒng)的細胞中獲得[50]。這進一步強調了維生素D和VDR對骨代謝以及先天性和適應性免疫的影響，并建議這些領域應進一步展開探索以用于商業(yè)應用。