楊震 黃春英 江河 姚金光右江民族醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，百色533000；右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，百色533000

0 引 言

頭頸部鱗癌（head and neck squamouscell carcinoma,HNSC）是包括口腔癌、咽癌、喉癌等在內(nèi)的頭頸部腫瘤的總稱，其總發(fā)病率較高，列所有癌癥的第6位，5年總生存率僅約50%[1]。對HNSC發(fā)生機(jī)制和預(yù)后的研究將有助于臨床上更好地對其進(jìn)行防治。

酪蛋白激酶1（casein kinase1,CK1）家族由7個已知的同工型（α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε）組成，普遍存在于真核生物中，其進(jìn)化保守，并作用于囊泡運(yùn)輸、DNA損傷修復(fù)、核糖體生物合成和細(xì)胞分裂分化等多個細(xì)胞功能[2-3]。CK1家族常被認(rèn)為是一類潛在的致癌基因，尤其是CK1α、CK1δ和CK1ε，可能通過p53和mdm2磷酸化影響β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性和中心體特異性功能而具有致癌作用[3]。

酪蛋白激酶1γ2（casein kinase 1 gamma 2，CSNK1G2）是CK1家族的一種同工型，有研究結(jié)果表明CSNK1G2能調(diào)節(jié)Wnt及Hedgehog信號通路，同時抑制轉(zhuǎn)化生長因子β的功能，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖，有利于腫瘤生長[4]。Li等[5]的研究結(jié)果證實CSNK1G2可磷酸化胰島素受體底物4，通過HSC70相互作用蛋白的羧基末端引發(fā)泛素/溶酶體途徑促進(jìn)胰島素受體底物4的多聚泛素化和降解，從而影響骨肉瘤細(xì)胞系生長。也有文獻(xiàn)報道，黏液性乳腺癌等其他惡性腫瘤中亦存在CSNK1G2的變異[6-7]。然而關(guān)于CSNK1G2在HNSC發(fā)生中的作用機(jī)制尚不完全清楚，本研究將應(yīng)用基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的UALCAN和Linked Omics數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站[8-9]、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫STRING[10]結(jié)合臨床病例標(biāo)本分析HNSC中CSNK1G2的表達(dá)情況及其臨床相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019年1月至2020年8月于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科就診被確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌并接受手術(shù)治療的患者21例。其中男性17例，女性4例，年齡（62.5±13.7）歲。收集手術(shù)切除的新鮮原發(fā)腫瘤組織標(biāo)本及對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本各21例，標(biāo)本取出后即凍存于液氮中。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

CSNK1G2基因引物序列、內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶引物序列[生工生物工程（上海）股份有限公司]，一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒[翌圣生物科技（上海）有限公司]。PB100勻漿機(jī)（英國Prima公司），LightCycler96 PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.3 方法

1.3.1 UALCAN數(shù)據(jù)分析

登錄UALCAN網(wǎng)站，點擊“analysis”，輸入基因“CSNK1G2”，選擇癌癥類型“head and neck squamous cell carcinoma”，點擊“Explore”后下載獲取不同分類的基因表達(dá)信息。

1.3.2 LinkedOmics數(shù)據(jù)分析

（一）CSNK1G2拷貝數(shù)突變和甲基化對CSNK1G2 mRNA表達(dá)量的影響

登錄LinkedOmics網(wǎng)站，選擇研究癌癥群組為“TCGA_HNSC”，數(shù)據(jù)庫為“SCNA”，研究基因為“CSNK1G2”，目的數(shù)據(jù)庫為“RNAseq”，選擇統(tǒng)計學(xué)方法“Spearman Correlation test”，提交并下載有關(guān)CSNK1G2 mRNA表達(dá)量的分析結(jié)果。將研究數(shù)據(jù)庫改為“Methylation”，重復(fù)上述操作獲得CSNK1G2甲基化與CSNK1G2 mRNA表達(dá)量的關(guān)系。

（二）CSNK1G2拷貝數(shù)突變、甲基化和mRNA表達(dá)量的生存分析

登錄LinkedOmics網(wǎng)站，選擇研究癌癥群組為“TCGA_HNSC”，數(shù)據(jù)庫分別為“SCNA”、“Methylation”、“RNAseq”，研究基因為“CSNK1G2”，目的數(shù)據(jù)庫為“clinical”，選擇統(tǒng)計學(xué)方法“Non-parametric T Test”,提交并下載“COX回歸檢驗”生存分析結(jié)果。

（三）CSNK1G2表達(dá)相關(guān)的基因富集分析和相關(guān)蛋白篩選

登錄LinkedOmics網(wǎng)站，選擇研究癌癥群組為“TCGA_HNSC”，數(shù)據(jù)庫為“RNAseq”，研究基因為“CSNK1G2”，目的數(shù)據(jù)庫分別為“RNAseq”和“RPPA”，選擇統(tǒng)計學(xué)方法“Spearman Correlation test”，提交后獲取相關(guān)數(shù)據(jù)。使用該網(wǎng)站內(nèi)置工具通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫注釋進(jìn)行基因富集分析并選擇Affinity Propagation方法聚類后得到的結(jié)果。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.3 STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

登錄STRING網(wǎng)站，選擇“Multiple proteins”，輸入上述過程中篩選得到的前10個最顯著相關(guān)的蛋白名稱，選擇人類蛋白數(shù)據(jù)庫，提交搜索，下載結(jié)果。

1.3.4 實時熒光定量PCR實驗

將收集的HNSC腫瘤及癌旁組織標(biāo)本取出，解凍，勻漿機(jī)勻漿，使用Trizol法提取標(biāo)本總RNA。引物序列包括：CSNK1G2基因正向引物序列5′-CGAGGTGCTCTGCGAGAACTTC-3′，反向引物序列5′-GAAGCCACTGCGGTCGAAGAG-3′；內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶正向引物序列5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。使用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒配置反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光定量PCR（r eal-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPC R）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，臨床病例標(biāo)本的RT-qPCR結(jié)果采用配對t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析不同分期分型HNSC癌組織中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)差異，數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析CSNK1G2拷貝數(shù)突變和甲基化與CSNK1G2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性（Spearman相關(guān)性分析）、3者的生存分析（非參數(shù)t檢驗）以及與CSNK1G2表達(dá)相關(guān)的基因和蛋白（Spearman相關(guān)性分析），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分期分型HNSC組織標(biāo)本中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量差異

使用UALCAN對TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)HNSC的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HNSC癌組織中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量明顯高于正常組織（P＜0.001，圖1A）；隨后的RT-qPCR實驗結(jié)果再次證實了原發(fā)腫瘤中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量高于癌旁組織（P=0.011，圖1B）。深入分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，不同病理分期、不同年齡階段和不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期（N分期）患者其原發(fā)腫瘤中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，圖1C～1E）；男性患者的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量高于女性患者（P＜0.001，圖1F）。而在腫瘤分化程度上CSNK1G2的mRNA表達(dá)量具有以下趨勢：G1分期（高分化）原發(fā)腫瘤中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量相對其他分期降低（均P＜0.05），G2分期（中分化）較G3分期（低分化）CSNK1G2 mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05），但G2分期與G4分期（未分化）、G3分期與G4分期間CSNK1G2 mRNA表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，圖1G）。此外，HPV陽性的HNSC患者較HPV陰性患者有著更高的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量（P=0.001，圖1H）。

圖1 不同分期分型HNSC組織標(biāo)本中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量差異

2.2 CSNK1G2拷貝數(shù)突變和甲基化對CSNK1G2 mRNA表達(dá)量的影響

運(yùn)用LinkedOmics進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSNK1G2拷貝數(shù)突變與其mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.001，圖2A），而CSNK1G2甲基化程度與其mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001，圖2B）。

圖2 CSNK1G2拷貝數(shù)突變和甲基化對CSNK1G2 mRNA表達(dá)量的影響

2.3 CSNK1G2拷貝數(shù)突變、甲基化和mRNA表達(dá)量的生存分析

LinkedOmics生存分析結(jié)果顯示：CSNK1G2 mRNA高表達(dá)預(yù)示更好的生存率（P=0.033，圖3A），而CSNK1G2基因甲基化的患者與基因野生型患者相比其生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.458，圖3B）；CSNK1G2拷貝數(shù)突變的患者其生存率較野生型患者高（P=0.015，圖3C）。

圖3 CSNK1G2 mRNA表達(dá)量、拷貝數(shù)突變和甲基化的生存分析

2.4 CSNK1G2表達(dá)相關(guān)基因的基因富集分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析出與CSNK1G2表達(dá)呈明顯相關(guān)的基因（圖4和5、表1），基因富集分析結(jié)果顯示相關(guān)的協(xié)同基因主要作用于DNA復(fù)制等方面（圖6）。同時，篩選出與CSNK1G2表達(dá)顯著相關(guān)的蛋白，并對最顯著相關(guān)的前10個蛋白運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示TP53、CHEK1和CHEK2可能在CSNK1G2介導(dǎo)的生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用（圖7、表2）。

圖6 與CSNK1G2表達(dá)正相關(guān)的基因富集注釋

圖7 與酪蛋白激酶1γ2表達(dá)相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

表1 CSNK1G2表達(dá)正相關(guān)基因

表2 與CSNK1G2表達(dá)顯著相關(guān)的蛋白

圖4 與CSNK1G2表達(dá)顯著相關(guān)的基因

圖5 與CSNK1G2表達(dá)正相關(guān)的基因

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNSC腫瘤中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量較正常組織明顯上調(diào)，且原發(fā)腫瘤的分化程度越高CSNK1G2 mRNA表達(dá)量亦越高，這可能預(yù)示著CSNK1G2基因?qū)τ谀[瘤生長與增殖極為關(guān)鍵。同時筆者注意到男性HNSC患者原發(fā)腫瘤中的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量高于女性，這與口腔癌、口咽癌等癌種中男性發(fā)病率高于女性的趨勢相一致[11]。作為HNSC中口咽癌、鼻咽癌等的一項重要危險性因素，HPV感染也與CSNK1G2表達(dá)存在明顯的正相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，CSNK1G2 mRNA表達(dá)量在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、不同病理分期和不同年齡階段均無差異。這些結(jié)果在一定程度上表明CSNK1G2在HNSC中表達(dá)上調(diào)可能是HNSC發(fā)生的重要危險因素，但其具體機(jī)制尚不清楚。

DNA甲基化和體細(xì)胞拷貝數(shù)突變常常是癌癥發(fā)生的重要原因[13-14]。在本研究中，CSNK1G2 mRNA表達(dá)量與CSNK1G2拷貝數(shù)突變存在正相關(guān)，而與CSNK1G2的甲基化程度呈顯著負(fù)相關(guān)；同時相關(guān)的生存分析結(jié)果顯示，更高的CSNK1G2 mRNA表達(dá)量和拷貝數(shù)突變預(yù)示著更好的生存率，而甲基化程度的差異與生存率無關(guān)。由此筆者認(rèn)為高水平的CSNK1G2拷貝數(shù)突變導(dǎo)致CSNK1G2 mRNA表達(dá)升高的同時促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。

進(jìn)一步探尋CSNK1G2促進(jìn)HNSC發(fā)生的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，CSNK1G2相關(guān)的共表達(dá)基因主要存在于DNA復(fù)制等環(huán)節(jié)。相關(guān)蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，癌基因TP53、CHEK1和CHEK2在與CSNK1G2相關(guān)的蛋白相互作用中處于核心位置。TP53是HNSC中最常見的突變基因，其通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期停滯、凋亡、衰老、DNA修復(fù)和新陳代謝等細(xì)胞功能的多種下游靶基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮腫瘤抑制功能，并與HNSC患者的短期生存率顯著相關(guān)[15]。CHEK1和CHEK2作為重要的細(xì)胞周期蛋白在腫瘤發(fā)生中亦具有重要作用[16-17]。上述研究結(jié)果提示TP53、CHEK1、CHEK2與CSNK1G2可能存在協(xié)同作用共同促進(jìn)了HNSC的發(fā)生。

綜上所述，CSNK1G2可能通過與TP53、CHEK1、CHEK2的協(xié)同作用促進(jìn)HNSC的發(fā)生，但對于腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散無影響，同時CSNK1G2的高表達(dá)預(yù)示著較好的臨床生存率。筆者推測CSNK1G2在HNSC的高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增長迅速，這使患者早期就診成為可能，并因此具有更佳的生存預(yù)后，但相關(guān)機(jī)制仍需探索明確。未來將通過對相關(guān)基因和蛋白的進(jìn)一步研究進(jìn)行更深入的探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突