余舜武,張小慶,陳守俊,葉水烽,張 余,羅利軍

(上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心,上海201106)

植物的生長發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)是在復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下完成的,其中蛋白質(zhì)磷酸化過程具有重要的信號(hào)傳遞功能。研究表明:細(xì)胞分裂原激活的蛋白激酶(MAPK,mitogen-activated protein kinase)級(jí)聯(lián)磷酸化過程在酵母、植物、動(dòng)物等真核生物中普遍存在,參與細(xì)胞分裂、生長、激素信號(hào)傳遞及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)[1-2]。MAPK級(jí)聯(lián)途徑在真核生物中高度保守,一般存在3種類型的蛋白激酶:MAPKKKs(MAPKs激酶的激酶)、MKKs(MAPKs激酶)和MAPKs。這3種激酶從上到下逐級(jí)磷酸化,將信號(hào)放大并傳遞下去,最后通過MAPKs磷酸化不同底物,如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、細(xì)胞骨架蛋白等,特異性調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),使細(xì)胞、組織、器官及整個(gè)生物體作出相應(yīng)反應(yīng)[1-2]。

植物中的MAPK級(jí)聯(lián)途徑錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及發(fā)育和脅迫響應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)與整合。不同的發(fā)育或脅迫信號(hào)可能通過同一條激酶鏈傳遞,同一來源的信號(hào)又有可能通過不同的激酶鏈傳導(dǎo),在錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)中MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)將信號(hào)巧妙有序地傳遞[1-3]。在三級(jí)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中,MKK家族基因位于中間,成員數(shù)最少,已知擬南芥、水稻和楊樹中只有8—10個(gè)成員,但第一級(jí)MAPKKK家族成員在擬南芥中多達(dá)80個(gè),第三級(jí)MAPK家族也有20個(gè)成員[4]。在復(fù)雜的MAPK級(jí)聯(lián)中,MKKs在MAPK級(jí)聯(lián)各條途徑中起到了樞紐作用,能夠有效地協(xié)調(diào)上游MAPKKKs和下游MAPKs之間的信號(hào)傳遞。

MAPK家族基因最開始被發(fā)現(xiàn)與酵母細(xì)胞分裂和分化相關(guān)[5],該系統(tǒng)在植物中也是保守存在的,如AtMKK6基因參與擬南芥細(xì)胞分裂[6-7]。此外,MAPK也被發(fā)現(xiàn)參與植物激素調(diào)控的生長,如AtMKK7基因過量表達(dá)抑制生長素的極性運(yùn)輸,導(dǎo)致擬南芥畸形發(fā)育[8]。還有報(bào)道認(rèn)為水稻MKK4級(jí)聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控谷粒大小[9]。但進(jìn)一步研究認(rèn)為,MAPKK家族基因與各種抗逆信號(hào)相關(guān),在抗病性和非生物脅迫中扮演更重要角色。如油菜BnMKK1基因能響應(yīng)多個(gè)非生物脅迫和激素處理,過量表達(dá)該基因改變了煙草株型,也改變了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性和抗病能力[10];水稻OsMKK3和OsMK K10.2基因正調(diào)控植物的抗病性,其中OsMK K10.2基因還能改善水稻的抗旱性[11-12]。

全基因組范圍內(nèi)研究MAPKK家族基因的表達(dá)模式已在擬南芥、棗、甜椒、西瓜和黃瓜等物種中開展,研究發(fā)現(xiàn)MAPKK家族基因與生長發(fā)育和逆境脅迫相關(guān),水稻中也有MKKs基因的相關(guān)研究,但并不充分[3,13-16]。為全面了解水稻MKKs基因在水稻發(fā)育進(jìn)程、激素和非生物逆境脅迫下的表達(dá)特點(diǎn),本試驗(yàn)利用不同發(fā)育時(shí)期不同器官組織的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)和模擬非生物脅迫處理的定量PCR分析研究水稻中MKK家族基因在發(fā)育內(nèi)部信號(hào)和環(huán)境外部逆境信號(hào)下的表達(dá)模式,以期為進(jìn)一步解析水稻MKKs基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

試驗(yàn)材料為水稻品種‘日本晴’,在正常的光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至水稻幼苗三葉一心期,分別用PEG6000(聚乙二醇6000)、NaCl、冷、熱和植物生長調(diào)節(jié)劑ABA(脫落酸)處理這些材料。

PEG6000滲透脅迫是將水稻幼苗由標(biāo)準(zhǔn)水稻營養(yǎng)液移入含20%PEG6000的水稻營養(yǎng)液中;NaCl處理是將幼苗由標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液移入含150 mmol∕L NaCl的營養(yǎng)液中;熱處理是將植株放在42℃生長箱中生長;冷處理是將植株放入4℃生長箱中生長;ABA處理是用100μmol∕L ABA噴灑水稻葉片。在處理前(即0 h)、處理后3 h、6 h、12 h、24 h以及恢復(fù)正常培養(yǎng)后24 h分別剪取葉片,迅速放入液氮中保存以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 OsMKK蛋白序列分析

根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)中心(http:∕∕www.ricedata.cn∕gene∕index.htm)水稻基因數(shù)據(jù),搜索TIGR Rice Genome Annotation(http:∕∕rice.plantbiology.msu.edu∕)數(shù)據(jù)庫并下載水稻OsMKK蛋白序列,從NCBI(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gene∕)數(shù)據(jù)庫下載擬南芥MKK蛋白質(zhì)序列,利用Clustal X對(duì)水稻和擬南芥MKK蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析,然后利用MEGA 4軟件構(gòu)建Neighbor-joining進(jìn)化樹。

1.3 OsMKK基因芯片表達(dá)譜分析

從CREP(http:∕∕crep.ncpgr.cn)芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫中提取水稻OsMKK基因的表達(dá)數(shù)據(jù),分別提取了‘珍汕97’‘明恢63’和‘汕優(yōu)63’3個(gè)水稻品種27個(gè)發(fā)育時(shí)期和組織的表達(dá)信號(hào)值和三葉幼苗期經(jīng)赤霉酸(GA3)、萘乙酸(NAA)和激動(dòng)素(KT)等處理的表達(dá)信號(hào)值,具體數(shù)據(jù)見參考文獻(xiàn)[2]。每個(gè)樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)的發(fā)育時(shí)間和所取的組織見表1。

1.4 反轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)分析

水稻葉片總RNA抽提采用Trizol法,具體使用方法參照中國TianGen公司TRNzol-A+Total RNA Reagent試劑盒說明書。以水稻總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成無基因組DNA的第一鏈cDNA(北京全式金生物公司TransCript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒);然后以cDNA為模板,用定量PCR的方法進(jìn)行表達(dá)量分析(TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒,PCR儀為ABI PRISM 7000 Real-Time PCR System)。用于定量PCR的MK K基因引物見表2。

表1 水稻不同發(fā)育時(shí)期芯片表達(dá)譜分析的組織樣品Table 1 Tissue samples for microarray expression profile spectrum analysis of rice at different development stages

表2 水稻MKK家族基因成員和定量用PCR引物Table 2 Members of rice MKK gene family and primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

圖1 水稻和擬南芥MKK蛋白家族的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of MKKs protein family in rice and Arabidopsis thaliana

2.1 OsMKK蛋白家族的進(jìn)化樹

參照TIGR Rice Genome Annotation(http:∕∕rice.plantbiology.msu.edu∕)數(shù)據(jù)庫和國家水稻數(shù)據(jù)中心(http:∕∕www.ricedata.cn∕gene∕index.htm)相關(guān)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)水稻中有8個(gè)OsMKK基因(表2),下載這些基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)OsMKK蛋白均具有在激活環(huán)中保守的天冬氨酸和賴氨酸殘基D(L∕I∕V)K和植物特異的磷酸化靶位點(diǎn)S∕TxxxxxS∕T。以擬南芥AtMKK蛋白序列作為參照,對(duì)OsMKK蛋白序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建Neighbor-joining進(jìn)化樹。如圖1所示,OsMKK蛋白分為4個(gè)亞家族,其命名與擬南芥同源蛋白保持一致,A亞族包括OsMKK1和OsMKK6蛋白;C亞族包含OsMKK4和OsMKK5蛋白,但水稻中缺少AtMKK8—9蛋白;D亞族中與AtMKK10蛋白同源性最高的OsMKK10蛋白有3個(gè);B亞族只有1個(gè)OsMKK3蛋白。

2.2 OsMKK基因在不同組織中的表達(dá)分析

CREP數(shù)據(jù)庫公開了Affymetrix芯片檢測數(shù)據(jù),利用基因ID號(hào)搜索水稻OsMKK基因在‘珍汕97’‘明恢63’和‘汕優(yōu)63’3個(gè)水稻品種27個(gè)不同發(fā)育時(shí)期組織器官的表達(dá)信號(hào)值。由于OsMKK10-3基因沒有對(duì)應(yīng)芯片探針信號(hào)值,故OsMKK10-3基因未納入統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明:OsMK K基因表達(dá)模式在不同時(shí)期不同組織中表達(dá)存在差異,且品種間也存在差異(圖2)。OsMKK1基因在不同組織中均能檢測到表達(dá),在葉片表達(dá)最高,幼穗中表達(dá)偏低,3個(gè)品種中‘珍汕97’表達(dá)最低。OsMKK4和OsMKK10-2基因表達(dá)與OsMK K1基因類似,葉片表達(dá)最高,幼穗中表達(dá)偏低。OsMKK3和OsMKK6基因表達(dá)模式聚在一起,OsMK K3基因整體表達(dá)量低,在幼穗中相對(duì)較高,胚乳中表達(dá)低,3個(gè)品種中‘珍汕97’表達(dá)相對(duì)偏高;OsMK K6基因整體表達(dá)量比OsMKK3基因偏高,其在愈傷組織、幼穗和胚乳中表達(dá)較高。OsMKK5與OsMK K10-1基因表達(dá)類似,雄蕊和幼穗中表達(dá)最低,但OsMKK10-1基因整體表達(dá)量很低,僅在胚乳中表達(dá)量高。表達(dá)模式聚類結(jié)果(圖2)與蛋白同源性聚類結(jié)果(圖1)不一致。

圖2 OsMKK家族基因表達(dá)模式的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of OsMKK family genes expression patterns

2.3 OsMKK基因在激素處理后的表達(dá)分析

OsMKK基因?qū)?種激素(GA3、NAA和KT)處理的表達(dá)數(shù)據(jù)值來源于CREP芯片數(shù)據(jù)。在不同激素處理下,OsMKK家族基因在3葉期的3個(gè)品種中表達(dá)量均呈現(xiàn)一定變化。以‘珍汕97’為例,OsMKK10-1、OsMK K3、OsMKK4和OsMK K6基因在激素處理后,除了個(gè)別處理稍有降低外,表達(dá)量均有一定提高(圖3)。OsMK K1、OsMKK5和OsMKK10-2基因表達(dá)量在激素處理后略有降低(圖3)。不同激素處理在品種間稍有變化,表明遺傳基礎(chǔ)的差異對(duì)激素反應(yīng)存在一定影響。如GA3處理后,‘明恢63’的OsMKK5和OsMK K6基因表達(dá)量上升,而其他2個(gè)品種降低(圖3)。

圖3 NAA、GA3和KT處理后水稻MKK基因的表達(dá)譜Fig.3 Expression profiles of OsMKK genes treated with NAA,GA3 and KT

2.4 OsMKK基因在非生物逆境下的表達(dá)模式分析

對(duì)水稻幼苗模擬非生物逆境脅迫處理,取處理不同時(shí)間的葉片抽提總RNA,采用qRT-PCR的方法分析OsMKK家族基因的表達(dá)模式。如圖4所示,20%PEG6000處理能誘導(dǎo)OsMKK家族基因的表達(dá)量上升。在處理的24 h內(nèi),OsMKK1、OsMKK3和OsMK K5基因在12 h時(shí)表達(dá)量最高,OsMKK4基因在處理24 h時(shí)最高。150 mmol∕L NaCl處理也能誘導(dǎo)OsMKK家族基因表達(dá)量上升,其中OsMK K1、OsMKK3、OsMK K4和OsMKK5基因在處理的24 h內(nèi)表達(dá)量持續(xù)升高,但NaCl處理對(duì)OsMKK10-2上調(diào)表達(dá)影響不顯著。低溫處理時(shí),OsMK K1、OsMKK4和OsMK K6基因表達(dá)量上升。高溫能誘導(dǎo)OsMKK1和OsMKK3基因在早期表達(dá)量上升,9 h后逐漸下降恢復(fù)常量表達(dá),OsMKK6和OsMK K10-2基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì),但不顯著。ABA處理能明顯誘導(dǎo)OsMKK1、OsMKK3和OsMKK5基因表達(dá)。綜上所述,在水稻MAPKK 4個(gè)亞家族中,A和C亞家族的OsMKK1、OsMKK6、OsMKK4和OsMK K5基因與非生物脅迫緊密相關(guān),受干旱、鹽、高溫等脅迫和植物激素ABA誘導(dǎo)表達(dá);B亞家族的OsMKK3基因與干旱、鹽脅迫和ABA處理相關(guān);D亞家族的OsMK K10-2基因在PEG6000和冷處理下略有上升,其他應(yīng)答不明顯,均與對(duì)照沒有顯著差異。以上結(jié)果說明,A∕B∕C亞家族的OsMKK基因均受非生物脅迫正調(diào)控。

圖4 不同逆境處理下‘日本晴’幼苗OsMKK基因的表達(dá)量分析Fig.4 Analysis of OsMKK genes expression in‘Nipponbare’seedlings under different stress treatments

3 討論

MKK家族基因是植物生長和逆境反應(yīng)中重要的信號(hào)傳導(dǎo)基因,其通過有限的幾個(gè)MKK成員將多個(gè)功能途徑共享到相同的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)中。從擬南芥MK K成員的時(shí)空表達(dá)特異性和復(fù)合信號(hào)系統(tǒng)的形成來看,MKK所參與的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)參與了植物的生長發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)[17]。本研究中,從不同發(fā)育時(shí)期的不同組織器官中的表達(dá)來看,OsMKK家族基因在水稻生長發(fā)育中的不同時(shí)期均有表達(dá),OsMK K1、OsMKK4和OsMK K10-2基因在營養(yǎng)器官中表達(dá)量偏高,而OsMKK3、OsMK K5和OsMKK10-1基因則在生殖器官中表達(dá)偏高,表明OsMKK家族基因在水稻生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都扮演了重要的角色。OsMK K4基因所在的MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)能調(diào)控細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖來影響穗的發(fā)育[8]。OsMKK4和OsMK K5基因同是水稻OsMKK家族C組成員,OsMKK5基因在‘明恢63’‘珍汕97’和‘汕優(yōu)63’3個(gè)品種的苗期表達(dá)量相對(duì)較低,但在穗及雄蕊中表達(dá)較高,說明OsMKK5可能與OsMKK4基因相似,參與調(diào)控花器官的發(fā)育。本研究還發(fā)現(xiàn),OsMKK基因?qū)ιL激素也存在一定的響應(yīng),這與擬南芥中的研究結(jié)果相似。擬南芥同源基因AtMKK3參與了植物激素GA3信號(hào)的調(diào)控,對(duì)擬南芥白天和黑夜的轉(zhuǎn)換起到重要作用[18]。此外,非生物脅迫處理也能誘導(dǎo)OsMKK4和OsMKK5基因表達(dá)明顯上調(diào),表明OsMKK基因家族C組成員在水稻非生物逆境和生長發(fā)育中均具有重要功能。值得注意的是,OsMKK基因家族A和B組成員對(duì)非生物逆境脅迫有響應(yīng),它們同時(shí)也在水稻生長發(fā)育過程中的各個(gè)組織中有表達(dá),這些結(jié)果進(jìn)一步表明植物中的MAPK級(jí)聯(lián)控制信號(hào)系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及植物整個(gè)發(fā)育階段和脅迫響應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)和整合[1-3]。

本研究表明,OsMK K基因參與多種非生物脅迫,在滲透脅迫、鹽、高低溫等脅迫處理時(shí)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。OsMK K1基因的表達(dá)能夠被多種非生物逆境脅迫和ABA誘導(dǎo),其同源基因AtMK K1∕2通過AtMEK K1-AtMKK1∕2-AtMPK4基因級(jí)聯(lián)途徑參與活性氧(ROS)平衡維持,使擬南芥在脅迫環(huán)境下正常生長,并能誘導(dǎo)與低濃度的活性氧有關(guān)的20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫[19]。除B亞家族只包含一個(gè)OsMK K基因成員外,其他亞家族都有2個(gè)以上成員,表明除B家族外的其他成員之間可能存在功能冗余。如A亞族中還存在一個(gè)OsMKK6基因成員,也參與鹽脅迫響應(yīng),在鹽處理下表達(dá)量上升。D亞家族的OsMK K10-2基因?qū)Ψ巧锩{迫不敏感,這與水稻MKK家族其他的大部分基因不一樣,因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)能被多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá),因此水稻MKK家族絕大多數(shù)基因都參與逆境脅迫反應(yīng)。這表明水稻MK Ks基因能夠介導(dǎo)由不同非生物脅迫刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),但基因功能是否存在冗余或者是每一個(gè)MK K基因鏈接的上下游是否一致,還需進(jìn)一步研究。

MKKs基因參與的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜的系統(tǒng),除了參與多種非生物脅迫外,OsMK K基因也參與了生物脅迫響應(yīng)。已有報(bào)道表明,水稻OsMKK3基因可激活下游MAPK和轉(zhuǎn)錄因子途徑來抵抗水稻白葉枯病和褐飛虱侵害[12,20]。更重要的發(fā)現(xiàn)是OsMKK10-2基因不僅能提高水稻的抗病性,同時(shí)能提高水稻的抗旱性[11]。以上結(jié)果表明:MKKs基因參與的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)具有多功能性,處于中間的核心位置并扮演著核心作用,不僅調(diào)控植物的生長發(fā)育,而且還對(duì)植物在生物逆境和非生物逆境下的自我保護(hù)作用發(fā)揮重要作用,因此有必要充分挖掘和理清水稻MKKs基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MKK家族基因在不同品種中的表達(dá)差異可能會(huì)影響到水稻的表型和農(nóng)藝性狀,深入研究水稻種質(zhì)資源中MKKs基因的功能差異,有助于解釋品種間農(nóng)藝性狀的差異,為水稻的現(xiàn)代化育種提供理論參考。