朱曉璐,韓 偉,馮 娜,唐慶九,袁 峰,徐國華,馮 杰*,張勁松

(1上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,國家食用菌工程技術研究中心,農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海市農業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海201403;2華東理工大學藥學院制藥工程與過程化學教育部工程研究中心,上海市新藥設計重點實驗室,上海200237;3江蘇神華藥業(yè)有限公司,江蘇省藥用真菌生物工程技術研究中心,淮安211600)

靈芝是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌,為我國名貴的中藥材,赤芝是栽培與應用最為廣泛且可作藥物使用的一種靈芝。多糖、三萜、甾醇及生物堿等物質均為靈芝中具有良好生物活性的有效成分,其中,三萜是靈芝最主要的活性成分之一。目前,研究發(fā)現(xiàn)的三萜類化合物已超過300種[1],由于其具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節(jié)、保護肝臟及神經(jīng)等作用[2-10],近年來成為國內外學者研究的熱點。

靈芝中三萜及甾醇的主要獲得途徑為人工栽培和液態(tài)發(fā)酵[11]。相較于人工栽培,液態(tài)深層發(fā)酵技術具有生產(chǎn)周期短、不受環(huán)境影響、產(chǎn)品質量穩(wěn)定、產(chǎn)量大、過程可控等優(yōu)勢。獲得高產(chǎn)三萜的靈芝發(fā)酵菌絲體主要有兩種途徑:一是對發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)進行優(yōu)化[12],二是添加外源物質調控三萜及甾醇的合成。目前已發(fā)現(xiàn)中藥提取物、金屬離子、茉莉酸甲酯、稀土元素、真菌激發(fā)子等皆可提高發(fā)酵體系中三萜及甾醇的含量[13-17]。油酸的添加可以刺激靈芝生物發(fā)酵過程中三萜的合成,從而得到高三萜含量、高收率的靈芝發(fā)酵菌絲體[18],且油酸價廉易得,具有食用安全的特點,因此成為一種良好的誘導靈芝三萜合成的外源物質[19]。

目前,有關靈芝中三萜液態(tài)深層發(fā)酵的研究尚停留在實驗室階段,規(guī)模化生產(chǎn)的報道很少。本實驗室前期進行了添加油酸誘導赤芝中三萜及甾醇合成的搖瓶培養(yǎng)試驗及6 L發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗[18],發(fā)現(xiàn)油酸的最佳添加量和時間分別為30 mL∕L和0 h,并利用Plackett-Burman設計對培養(yǎng)基中的葡萄糖與硫酸鎂含量及發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化,最終在優(yōu)化條件下6 L發(fā)酵罐所得發(fā)酵產(chǎn)物中三萜及甾醇含量達1.076 g∕L;還探究了赤芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中通氣量[20]與溫度調控[21]對三萜及甾醇含量的影響。此外,本實驗室開發(fā)了一種簡單可重現(xiàn)的兩階段攪拌速度控制策略,以實現(xiàn)同時滿足高濃度、高產(chǎn)量、高生產(chǎn)率的赤芝三萜及甾醇液態(tài)深層發(fā)酵工藝[22];并基于Logistic和Luedeking-Piret方程構建了靈芝細胞生長、底物消耗、三萜形成的非結構動力學模型,通過Runge-Kutta遺傳算法優(yōu)化了模型的動力學參數(shù),該模型可指導赤芝液態(tài)深層發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)[23]?；诖?本研究擬采用工業(yè)級別1 000 L發(fā)酵罐進行放大,將獲得的赤芝菌絲體發(fā)酵濃縮物(包括菌絲體及胞外液)經(jīng)醇提濃縮后,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,對不同萃取物的抗腫瘤活性進行測定與評價,以期篩選出赤芝發(fā)酵產(chǎn)物的活性部位,進而為赤芝液態(tài)深層發(fā)酵的規(guī)?；苽浼捌浠钚猿煞盅芯刻峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和細胞

赤芝Ganoderma lucidumG0023由上海市農業(yè)科學院食用菌研究所深加工技術與發(fā)酵工程研究室提供。

L1210:小鼠白血病細胞株;K562:人慢性髓原白血病細胞株。以上細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要試劑

5-氟尿嘧啶(5-FU,美國Sigma公司);Alamar Blue Assay Kit(美國Biosource公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(美國Gibco公司);青霉素、鏈霉素(美國Amresco公司);乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為國藥試劑分析純。

1.2.2 主要儀器

1 000 L發(fā)酵罐(江蘇神華藥業(yè)有限公司);旋轉蒸發(fā)儀(德國BüCHI公司);真空離心濃縮儀(德國Christ公司);多功能倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司);二氧化碳培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司);細胞計數(shù)儀(美國Beckman-Coulter公司);臺式高速大容量離心機(德國Eppendorf公司);電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司);超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g∕L,801酵母粉3 g∕L,磷酸二氫鉀2 g∕L,七水硫酸鎂2 g∕L,自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基:油酸30 mL∕L,葡萄糖30 g∕L,801酵母粉3.5 g∕L,磷酸二氫鉀2 g∕L,七水硫酸鎂2 g∕L,自然pH。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

挑取保藏菌株接種于PDA培養(yǎng)基上,并于26℃進行活化培養(yǎng)。

1.4.2 種子液培養(yǎng)

將菌塊接種到種子培養(yǎng)基中,制備種子液。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

轉接種子培養(yǎng)液到1 000 L發(fā)酵罐中,裝液量700 L,接種量10%;培養(yǎng)溫度26℃;無攪拌,100 r∕min;通氣比0.8,對應通氣量560 L∕min。

1.5 測定方法

發(fā)酵過程中每隔24 h取樣檢測pH;將赤芝菌絲體用95%(體積分數(shù),下同)乙醇清洗,去除表面附著的油酸,離心后收集菌絲體,取適量按料液比1∶50(g∕mL)加入95%乙醇并用細胞破碎儀破碎4 min,再于60℃、400 W條件下超聲提取1 h,重復1次,離心合并上清液,定容后采用香草醛-冰醋酸法[21]測定三萜及甾醇含量。

1.6 樣品的濃縮、提取與制備

發(fā)酵結束后,將700 L發(fā)酵液直接減壓濃縮獲得30 L待用的赤芝發(fā)酵濃縮物,然后加入70 L無水乙醇浸提48 h,再將其殘渣過濾后以14 L無水乙醇浸提2次,每次24 h,得到的乙醇提取物經(jīng)減壓濃縮后,依次用石油醚、乙酸乙酯等體積萃取各3次,分別減壓濃縮回收溶劑,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和剩余水溶性物質,取少量各萃取物進行減壓離心濃縮后備用。

1.7 抗腫瘤活性試驗

精確稱取3種萃取物,在無菌條件下用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成40 mg∕mL(作用終質量濃度200μg∕mL)的樣品溶液,再依次將樣品稀釋成20 mg∕mL(作用終質量濃度100μg∕mL)、10 mg∕mL(作用終質量濃度50μg∕mL)和5 mg∕mL(作用終質量濃度25μg∕mL)備用。

將L1210、K562細胞分別接于RPMI 1640培養(yǎng)基中,放入5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃及飽和濕度下進行傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的L1210、K562細胞分別以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成2×104個∕mL的細胞懸液,按每孔199μL加入96孔板,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后再加入1μL不同濃度待測樣品,每個濃度3個平行。陰性對照為1μL的DMSO,陽性對照為1μL的5-FU和1μL的油酸(作用終質量濃度皆為50μg∕mL),置于培養(yǎng)箱中72 h后取出,每孔加入30μL 0.1 mg∕mL Alamar Blue試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4—6 h后,于570 nm和600 nm兩個波長下測定吸光度值。依據(jù)Alamar Blue試劑計算公式得出各樣品對腫瘤細胞的抑制率[24]。

式中:A1為樣品在570 nm波長下的吸光度;A2為樣品在600 nm波長下的吸光度;A3為陰性對照在570 nm波長下的吸光度;A4為陰性對照在600 nm波長下的吸光度。

1.8 統(tǒng)計分析

pH、三萜及甾醇含量的測定以及抗腫瘤活性試驗均作3次平行重復,試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。采用Excel 2013軟件處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 赤芝菌絲體發(fā)酵過程中三萜及甾醇含量測定

液態(tài)深層發(fā)酵過程中的pH變化范圍為4.44—5.00,呈現(xiàn)出緩慢降低的趨勢,這與發(fā)酵過程中酸性代謝產(chǎn)物的生成有關,也符合靈芝的液態(tài)深層發(fā)酵規(guī)律[25]。

如圖1所示,與相同條件下未添加油酸的赤芝發(fā)酵產(chǎn)物中的三萜及甾醇含量變化相比,添加油酸的赤芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中處于延滯期的時間很短,可以快速進入對數(shù)生長期,三萜及甾醇含量增長較快,并于24 h后保持穩(wěn)定增長的態(tài)勢,120 h時達到最大值8.91 mg∕(100 mg干菌絲)?？梢?油酸的添加對促進赤芝中三萜及甾醇的合成具有重要作用。

圖1 添加油酸對赤芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中三萜及甾醇含量的影響Fig.1 Effects of oleic acid on the content of triterpenoids and sterols in submerged fermentation of G.lucidum

2.2 赤芝發(fā)酵產(chǎn)物不同萃取物的抗腫瘤活性

由圖2可知,在高濃度條件下,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和剩余水溶性物質對L1210細胞增殖均表現(xiàn)出較好的抑制作用;中等濃度時,石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物依舊有著良好的抗腫瘤活性,抑制率均高于90%,而剩余水溶性物質抑制率下降較明顯;低濃度條件下,各萃取物抑制率均有一定程度下降,但乙酸乙酯萃取物的抑制率仍達到了83.65%,可見其對L1210細胞有著極強的抑制作用。油酸對L1210細胞無抑制效果,因此可以忽略各萃取物中可能殘留的油酸對抑制率結果的影響。

如圖3所示,石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物在200μg∕mL和100μg∕mL時對K562細胞的抑制率高達89%以上,而在50μg∕mL和25μg∕mL時下降明顯,但與陽性對照5-FU相比,50μg∕mL的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的抑制率仍略高;剩余水溶性物質在高濃度條件下抑制率僅為62.75%,其余濃度條件下均不到30%,對K562的抑制作用不佳。同樣,油酸對K562細胞幾乎亦無抑制效果,因此可以忽略各萃取物中可能殘留的油酸對抑制率結果的影響。

圖2 不同萃取物對L1210細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition of different extracts on the proliferation of L1210 cells

圖3 不同萃取物對K562細胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of different extracts on the proliferation of K562 cells

3 討論與結論

本研究采用添加油酸促進液態(tài)深層發(fā)酵過程中赤芝三萜及甾醇生成的方法,以1 000 L的工業(yè)級別發(fā)酵罐規(guī)?；苽浍@得30 L赤芝發(fā)酵濃縮物。對比早期200 L攪拌槽生物反應器[26],本研究在規(guī)模上取得了較大進展,此外,所得赤芝發(fā)酵產(chǎn)物中的三萜及甾醇含量相較于先前報道[27-28]也表現(xiàn)出了較大優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn):石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對L1210及K562兩種腫瘤細胞都表現(xiàn)出良好的抑制作用,其抑制作用強度均高于剩余的水溶性物質,由此可推測弱極性的甾醇及中等極性的三萜類化合物可能是發(fā)酵產(chǎn)物中主要的抗腫瘤活性物質,這為赤芝液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)物后續(xù)的分離純化及其在醫(yī)藥、食品、保健品行業(yè)的研究與應用提供了依據(jù),也為今后規(guī)?；苽涑嘀グl(fā)酵產(chǎn)物開拓了思路。