劉哲宇，申屠琰，楊 程，朱衛(wèi)東，王志錚

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，寧波余姚 315400）

棘胸蛙Quasipaa spinosa 素有“百蛙之王”之美譽(yù)，是一種極具養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)潛力的經(jīng)濟(jì)蛙種。開(kāi)展棘胸蛙養(yǎng)殖已成為當(dāng)前我國(guó)南方丘陵山區(qū)脫貧致富的重要途徑之一。近年來(lái)，隨著我國(guó)生態(tài)環(huán)境保護(hù)力度的加大以及各地新一輪養(yǎng)殖水域?yàn)┩恳?guī)劃的密集出臺(tái)和堅(jiān)決落實(shí)，棘胸蛙山區(qū)傳統(tǒng)養(yǎng)殖發(fā)展空間日益受限，大力實(shí)施棘胸蛙平原集約化養(yǎng)殖與山區(qū)生態(tài)化放養(yǎng)相結(jié)合的養(yǎng)殖新模式現(xiàn)已成為推進(jìn)我國(guó)棘胸蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型和健康可持續(xù)發(fā)展的必由之路。蝌蚪既是棘胸蛙在水體環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵階段，也是實(shí)施棘胸蛙平原集約化養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)?；诃h(huán)境友好的水質(zhì)控制是保障水產(chǎn)動(dòng)物集約化養(yǎng)殖正常運(yùn)行的關(guān)鍵，因此精準(zhǔn)掌握水產(chǎn)動(dòng)物適宜的水質(zhì)理化環(huán)境要求就顯得十分必要。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于水質(zhì)理化因子對(duì)棘胸蛙蝌蚪生理生態(tài)的影響研究?jī)H涉及水溫和氨氮[1-5]，而有關(guān)pH 的影響研究則迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。

pH 因作為指示水體酸堿電離平衡狀況和綜合反映水質(zhì)優(yōu)劣程度的重要理化指標(biāo)，而成為評(píng)價(jià)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境是否達(dá)標(biāo)的必檢項(xiàng)[6]。研究表明，pH 易變的養(yǎng)殖水體，不僅可通過(guò)影響水中物質(zhì)的存在形式和遷移過(guò)程間接毒害水生動(dòng)物，而且還可通過(guò)直接影響水生動(dòng)物的載氧能力麻痹其呼吸中樞，pH 過(guò)高或過(guò)低均可以破壞水生動(dòng)物的抗氧化酶活性并引發(fā)多種機(jī)體損傷癥狀[7-8]。因此，找尋養(yǎng)殖對(duì)象的適宜pH 范圍并探究其對(duì)pH 脅迫的生理生態(tài)應(yīng)答過(guò)程與機(jī)制一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究的常規(guī)命題之一。無(wú)尾類(lèi)蝌蚪皮膚具高滲透性，具呼吸和滲透壓調(diào)節(jié)等多種功能，且機(jī)體總耗氧量的60%源自于皮膚[9]，當(dāng)其受到污染脅迫時(shí)，在細(xì)胞、組織及生理生化水平上都會(huì)發(fā)生顯著變化，而被認(rèn)為是開(kāi)展毒理學(xué)研究的理想材料之一[10-11]；肝臟是脊椎動(dòng)物的代謝中樞、解毒中心和主要耗氧器官，具較強(qiáng)的抗氧化酶系統(tǒng)[12]，環(huán)境因子的劇烈變化能增強(qiáng)肝臟細(xì)胞中氧化酶系統(tǒng)的活力，從而產(chǎn)生較多的活性氧自由基[13]，兩者均是棘胸蛙蝌蚪響應(yīng)水質(zhì)理化因子急性脅迫的重要靶器官[1-3]。鑒于此，本文作者較系統(tǒng)地開(kāi)展了棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚和肝臟對(duì)pH 急性脅迫及恢復(fù)的抗氧化應(yīng)答研究，以期為棘胸蛙蝌蚪的安全養(yǎng)殖和相關(guān)抗逆生理學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用水

實(shí)驗(yàn)水源為經(jīng)48 h 自然曝氣的自來(lái)水，水溫（24±0.2）℃、DO（7.30±0.01）mg·L-1、pH（7.30±0.01），水質(zhì)符合《NY 5051-2001 無(wú)公害食品 淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》要求。采用AR 級(jí)濃HCl 及NaOH 調(diào)制實(shí)驗(yàn)用水的pH，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2 供試蝌蚪

購(gòu)自余姚市陸埠鎮(zhèn)石門(mén)村下魯石蛙養(yǎng)殖場(chǎng)的1 月齡同生群個(gè)體。運(yùn)送至浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)安全養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室,即刻停食并暫養(yǎng)于若干規(guī)格為80 cm×50 cm×42 cm 的白色塑料水槽（實(shí)際容積75 L）內(nèi)，暫養(yǎng)期間及時(shí)撈除死亡個(gè)體，日換水1 次,換水率為100%。靜水停食2 d，待徹底排空體內(nèi)糞便后,選取其中體表光滑、體色相近、反應(yīng)靈敏、游動(dòng)活潑的健康個(gè)體作為研究對(duì)象，具體規(guī)格為體長(zhǎng)（1.932±0.204）cm、體質(zhì)量（1.386±0.055）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定pH 急性脅迫下蝌蚪96 h 全活范圍后，按等差法設(shè)置5.5、6.5、7.0、7.5、8.5 和9.5 等6個(gè)pH 實(shí)驗(yàn)梯度組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)各投放蝌蚪10 ind（實(shí)驗(yàn)密度為200 ind·m-3），采用靜水停飼實(shí)驗(yàn)法按時(shí)隨機(jī)取樣供試蝌蚪作為測(cè)定樣本。其中，急性脅迫取樣時(shí)點(diǎn)分別為24、48、72 和96 h；pH 恢復(fù)為7.0，取樣時(shí)點(diǎn)分別6 d 和12 d。每一取樣時(shí)點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)梯度組的測(cè)定樣本量均為3 ind。取樣后，即刻將樣本置于冰盤(pán)上，逐尾剪取肝臟和尾部皮膚組織并依次放入已編號(hào)的取樣袋后，即刻存放于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備測(cè)。

尾部皮膚組織的測(cè)定指標(biāo)為ATP 酶、SOD 酶和CAT 酶活力，肝臟的測(cè)定指標(biāo)為SOD 酶、CAT 酶和GSH-Px 酶活力。完成上述測(cè)定指標(biāo)所需的測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，并均按所附說(shuō)明書(shū)要求完成上述指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 尾部皮膚的ATP 酶活力

由圖1 可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪尾部皮膚ATP 酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：（1）pH 急性脅迫階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)的酶活力隨pH 升高大體上均呈先降后升的趨勢(shì)，且谷底值均出現(xiàn)于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），以pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組為界，pH 大于7.5 實(shí)驗(yàn)組別的酶活力均顯著低于pH 小于7.5 的實(shí)驗(yàn)組別（P＜0.05）;（2）pH 恢復(fù)階段各測(cè)定時(shí)點(diǎn)的酶活力變化趨勢(shì)與急性脅迫階段類(lèi)似，所不同的是pH 7.0 實(shí)驗(yàn)組與pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組之間，以及pH 6.5 實(shí)驗(yàn)組與pH 8.5 實(shí)驗(yàn)組之間的酶活力均無(wú)顯著差異（P＞0.05），且各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)恢復(fù)6 d 和12 d 的酶活力也均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；（3）以96 h 酶活力為參照，恢復(fù)階段僅pH 7.0 和pH 7.5 兩實(shí)驗(yàn)組的酶活力與相對(duì)應(yīng)的參照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），其它實(shí)驗(yàn)組的酶活力均顯著大于相對(duì)應(yīng)的參照組（P＜0.05）。綜上可知，就皮膚ATP 酶活力而言，棘胸蛙蝌蚪偏好弱堿性環(huán)境，以pH 7.5 最為適宜，pH 急性脅迫對(duì)蝌蚪皮膚生理功能具持久性影響。

圖1 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪尾部ATP 酶活力的變化Fig.1 The ATP activity in Q.spinosa tadpole tail in different pH

2.2 尾部皮膚和肝臟SOD 酶活力

由圖2 和圖3 可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪尾部皮膚和肝臟的SOD 酶活力變化特征主要表現(xiàn)為：（1）pH 急性脅迫階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)尾部皮膚和肝臟酶活力均大體上隨pH 升高表露先升后降的趨勢(shì)，且峰值均出現(xiàn)于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；（2）pH 恢復(fù)階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)尾部皮膚和肝臟酶活力隨pH 升高均表露為“上升—穩(wěn)定—下降”的趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)酶活力均無(wú)顯著差異（P＞0.05），其中尾部皮膚和肝臟酶活力組間無(wú)顯著差異的則分別為pH 7.0、7.5 實(shí)驗(yàn)組和pH 7.0、7.5 和8.0 實(shí)驗(yàn)組（P＞0.05）；（3）以96 h 酶活力為參照，尾部皮膚和肝臟在恢復(fù)階段與相對(duì)應(yīng)的參照組無(wú)顯著差異的實(shí)驗(yàn)組僅分別為pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組和pH 7.0、7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＞0.05），其它實(shí)驗(yàn)組酶活力均顯著大于相對(duì)應(yīng)的參照組（P＜0.05）。綜上可知，就SOD 酶活力而言，pH 急性脅迫對(duì)棘胸蛙蝌蚪皮膚和肝臟的生理功能具持久性影響，其中皮膚較肝臟對(duì)pH 急性脅迫更顯敏感，兩者均偏好弱堿性環(huán)境，適宜范圍分別為7.0～7.5 和7.0～8.0，均以7.5 最為適宜。

圖2 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪尾部SOD 酶活力的變化Fig.2 The SOD activity in Q.spinosa tadpole tail in different pH

圖3 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪肝臟SOD 酶活力的變化Fig.3 The SOD activity in Q.spinosa tadpole liver in different pH

2.3 尾部皮膚和肝臟CAT 酶活力

由圖4 和圖5 可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪尾部皮膚和肝臟的CAT 酶活力變化特征主要表現(xiàn)為：（1）pH 急性脅迫階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)尾部皮膚和肝臟酶活力均大體上隨pH 升高表露先升后降的趨勢(shì)，且峰值絕大多均出現(xiàn)于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；（2）pH 恢復(fù)階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)尾部皮膚和肝臟酶活力隨pH 升高均表露為“上升—穩(wěn)定—下降”的趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)酶活力均無(wú)顯著差異（P＞0.05），組間無(wú)顯著差異的則僅為pH 7.0 和7.5 兩實(shí)驗(yàn)組（P＞0.05）；（3）以96 h 酶活力為參照，尾部皮膚和肝臟在恢復(fù)階段與相對(duì)應(yīng)的參照組無(wú)顯著差異的均僅為pH 7.0 和pH 7.5 兩實(shí)驗(yàn)組（P＞0.05），其它實(shí)驗(yàn)組酶活力均顯著大于相對(duì)應(yīng)的參照組（P＜0.05）。綜上可知，就CAT 酶活力而言，pH 急性脅迫對(duì)棘胸蛙蝌蚪皮膚和肝臟生理功能均具持久性影響，其中皮膚與肝臟對(duì)pH 急性脅迫的敏感性相近，兩者均偏好弱堿性環(huán)境，且均以7.5 最為適宜。

圖4 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪尾部CAT 酶活力的變化Fig.4 The CAT activity in Q.spinosa tadpole tail in different pH

圖5 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪肝臟CAT 酶活力的變化Fig.5 The CAT activity in Q.spinosa tadpole liver in different pH

2.4 肝臟GSH 酶活力

由圖6 可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪肝臟GSH 酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：（1）pH 急性脅迫階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)的酶活力隨pH 升高均大體上呈先降后升的趨勢(shì)，且谷底值均于出現(xiàn)于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），以pH 7.0 實(shí)驗(yàn)組為界，pH 大于7.0 實(shí)驗(yàn)組別的酶活力均顯著低于pH 小于7.0 的實(shí)驗(yàn)組別（P＜0.05）；（2）pH 恢復(fù)階段各測(cè)定時(shí)點(diǎn)的酶活力變化趨勢(shì)與急性脅迫階段類(lèi)似，所不同的是pH 7.0實(shí)驗(yàn)組與pH 8.0 實(shí)驗(yàn)組之間，以及pH 6.5 實(shí)驗(yàn)組與pH 8.5 實(shí)驗(yàn)組之間的酶活力均無(wú)顯著差異（P＞0.05），且各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)恢復(fù)6 d 和12 d 的酶活力也均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；（3）以96 h 酶活力為參照，pH 恢復(fù)階段僅pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組的酶活力與相對(duì)應(yīng)的參照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），其它實(shí)驗(yàn)組的酶活力均顯著大于相對(duì)應(yīng)的參照組（P＜0.05）。綜上可知，就肝臟GSH 酶活力而言，棘胸蛙蝌蚪偏好弱堿性環(huán)境，適宜范圍為7.0～7.5，以pH 7.5 最為適宜，pH 急性脅迫對(duì)蝌蚪肝生理功能具持久性影響。

圖6 不同pH 條件下棘胸蛙蝌蚪肝臟GSH-Px 酶活力的變化Fig.6 The GSH activity in Q.spinosa tadpole liver in different pH

3 討論

3.1 棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚和肝臟對(duì)pH 急性脅迫的抗氧化應(yīng)答特征

pH 急性脅迫階段，各測(cè)定時(shí)點(diǎn)蝌蚪的尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力隨水環(huán)境pH 增加均呈“V”型變化的結(jié)果（圖1、圖6），表明蝌蚪尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力均對(duì)于偏離其適宜pH 的水環(huán)境表露出明顯的毒害興奮效應(yīng)，與其受水溫和氨氮急性脅迫下的情形相反[1-2]；各測(cè)定時(shí)點(diǎn)蝌蚪尾部皮膚和肝臟的SOD、CAT 酶活力隨水環(huán)境pH 增加均基本呈“Λ”型變化的結(jié)果（圖2、圖3、圖4、圖5），表明蝌蚪尾部皮膚和肝臟的SOD、CAT 酶活力均對(duì)于偏離其適宜pH 的水環(huán)境表露出明顯的抑制效應(yīng)，均與其受氨氮急性脅迫下的情形基本相仿[6]。由此可基本認(rèn)定，增強(qiáng)尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力并抑制尾部皮膚和肝臟SOD、CAT 酶活力是棘胸蛙蝌蚪對(duì)pH 急性脅迫的抗氧化應(yīng)答特征。

肝臟是有機(jī)體的能量代謝中樞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有機(jī)體內(nèi)約90%的氧自由基源自能量和氧自由基加工廠的線粒體。尾部是蝌蚪的運(yùn)動(dòng)器官。蝌蚪皮膚與水環(huán)境直接接觸，既是其主要呼吸器官，也是其重要的水—血屏障。故本研究中因pH 不適導(dǎo)致蝌蚪尾部皮膚ATP 酶活力顯著增高（圖1）的同時(shí)，也勢(shì)必引發(fā)蝌蚪尾部皮膚和肝臟氧自由基含量的激增。研究表明，適量的氧自由基可增強(qiáng)對(duì)水生動(dòng)物的免疫保護(hù)，為其正常生理活動(dòng)所必需[14]；而當(dāng)氧自由基過(guò)量并超出其機(jī)體清除能力時(shí)，則會(huì)對(duì)有機(jī)體產(chǎn)生氧化壓力[15]；SOD、CAT和GSH-Px 是棘胸蛙蝌蚪體內(nèi)協(xié)同參與清除氧自由基的主要抗氧化酶類(lèi)，其酶活力的高低不僅可映射體內(nèi)需清除的氧自由基量的多寡，而且也可反映機(jī)體受氧自由基氧化損害的程度或水平[1-2]。由此，本研究中棘胸蛙蝌蚪受pH 急性脅迫下尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力的顯著高起（圖1、圖6）以及尾部皮膚和肝臟SOD、CAT 酶活力的顯著下降（圖2、圖3、圖4、圖5），無(wú)疑表明棘胸蛙蝌蚪對(duì)pH 急性脅迫的抗氧化應(yīng)答特征與其皮膚呼吸供氧壓力和肝臟能量代謝負(fù)擔(dān)同步顯著增加有著極為密切的關(guān)系，即受抑的皮膚呼吸作用在顯著增進(jìn)蝌蚪尾部運(yùn)動(dòng)能量負(fù)擔(dān)的同時(shí)，也必將對(duì)肝臟產(chǎn)生極為明顯的抗氧化損害，這一應(yīng)答機(jī)制所表露的“由表及里”和“表里互通”惡性循環(huán)特征，既與棘胸蛙蝌蚪受氨氮急性脅迫的損害情形相似[2,5]，也與蟾蜍蝌蚪在除草劑制劑攻毒下的理化應(yīng)答機(jī)制相吻[16]，同時(shí)也從側(cè)面印證了過(guò)低的pH 會(huì)影響越冬過(guò)程中林蛙皮膚的呼吸作用甚至造成大量死亡現(xiàn)象的可靠性[17]。

3.2 棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚和肝臟對(duì)pH 急性脅迫后恢復(fù)期的抗氧化響應(yīng)特征

以各實(shí)驗(yàn)組pH 急性脅迫96 h 時(shí)點(diǎn)的酶活力為參照，諸實(shí)驗(yàn)組在pH 恢復(fù)階段除pH 7.0 和7.5 兩實(shí)驗(yàn)組的尾部皮膚ATP、SOD、CAT 酶活力和肝臟SOD、CAT、GSH-Px 酶活力均與其相對(duì)應(yīng)的參照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）外，其余均顯著大于與其相對(duì)應(yīng)的參照組（P＜0.05）的結(jié)果，在進(jìn)一步說(shuō)明棘胸蛙蝌蚪生存水環(huán)境的最適pH 為7.5 的同時(shí)，直接反映了消除pH 急性脅迫后蝌蚪尾部皮膚和肝臟SOD、CAT 酶活力所表露的可逆效應(yīng)，以及尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力的增益效應(yīng)，從而揭示了蝌蚪可通過(guò)改善供氧環(huán)境條件和提高供氧效率有效減弱對(duì)肝臟能量代謝和尾部運(yùn)動(dòng)代謝負(fù)面壓力的本質(zhì)。

就圖2、圖3、圖4、圖5 中諸實(shí)驗(yàn)組酶活力在pH 恢復(fù)6 d 和12 d 間均無(wú)顯著差異（P＞0.05），且尾部皮膚ATP 酶和肝臟GSH-Px 酶活力均仍持續(xù)顯著大于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），和尾部皮膚和肝臟的SOD、CAT 酶活力均仍持續(xù)顯著小于pH 7.5 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）的情形看，pH 急性脅迫對(duì)蝌蚪機(jī)體正常的抗氧化生理機(jī)能可產(chǎn)生持久性影響，且不因pH 急性脅迫的消除而在短期內(nèi)獲得完全修復(fù)，這可能與體內(nèi)短時(shí)間大量產(chǎn)生的自由基受鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用由一個(gè)大分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)大分子從而導(dǎo)致機(jī)體組織的廣泛損傷有關(guān)[18]。