穆 軍，蔣廣寧，陳 蔭

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

絮凝劑廣泛用于工業(yè)廢水處理、飲用水處理、脫色、重金屬去除、采礦業(yè)和紡織業(yè)等[1]。絮凝劑可以使液體中的膠體顆粒形成較大的顆粒以沉降，因此可用于去除污染廢水的濁度和懸浮固體等。然而無機絮凝劑和合成類絮凝劑的大量使用，對環(huán)境產生了二次污染，微生物絮凝劑應運而生。與傳統(tǒng)絮凝劑相比，微生物絮凝劑有安全，無毒，環(huán)保且用量少等優(yōu)點[2-3]。生物絮凝劑的組分主要包括蛋白質、多糖、核酸和纖維素，其中多糖是主要組分[4]。由于多糖化學結構的多樣性，人們對胞外多糖的微生物活性進行了許多研究[3-5]。胞外多糖是由細菌和其他微生物分泌的細胞外聚合物，并且在許多方面表現(xiàn)出良好的活性，例如絮凝和脫色。然而，獲得純多糖產品成本高，產率低，發(fā)酵過程長，限制了其廣泛應用。因此探究其中的作用機制，將有利于通過人工合成、生態(tài)仿生等途徑來降低絮凝劑的生產成本，促進微生物絮凝劑的發(fā)展。

菲律賓蛤仔對海水有著特殊的絮凝效果，推測絮凝效果與蛤仔黏附污泥中的微生物有關。實驗室前期從黏附污泥中篩選出14 株絮凝活性菌株，選取菌株Halomonassp.GHF11，從其發(fā)酵液中提取細胞外多糖，并通過柱層析純化多糖進行結構表征。該多糖有約70%的絮凝率外，對染料孔雀石綠的脫色率可達90%。研究表明，多糖是發(fā)揮絮凝作用的主要活性物質。通過分析多糖的單糖組成、糖苷鍵連接方式來探究化學結構與優(yōu)異性能之間的相關性，有助于理解絮凝機理并充分發(fā)揮其潛在的應用價值[6]。

本文從絮凝活性菌株的發(fā)酵液中提取微生物多糖，通過柱層析純化獲得多糖純物質，并通過一系列分析對純化的多糖進行結構表征，包括單糖組成、紅外光譜分析、分子量測定、甲基化分析，對其結構的研究有利于對海洋微生物資源利用，并為新型微生物多糖的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株Halomonassp.GHF11 是從菲律賓蛤仔黏附污泥中篩選獲得，具有較高的絮凝活性。

主要試劑：乙醇、硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸（TFA）、二甲基亞砜（DMSO）、CH3COOH、吡啶為國產分析純，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和乙腈（HPLC 級），12 種單糖標準品：D-鼠李糖、D-核糖、D-甘露糖、D -葡萄糖、D-氨基半乳糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸。

菌株GHF11 用以下培養(yǎng)基（g·L-1）培養(yǎng)：K2HPO4，5；KH2PO4，2；CO（NH2）2，0.5；（NH4）2SO4，0.2；酵母提取物，0.5；葡萄糖，20；溶于1 L 人工海水（ASW）中，初始pH 為7.5。

人工海水組分（g·L-1）：MgCl2·6H2O，9.68；KCl，0.61；Na2SO4，3.47；NaCl，30.0；Na2HPO4，0.014；NaHCO3，0.17；CaCl2·2H2O，1.36；KBr，0.10；SrCl2·6H2O，0.04 和H3BO3，0.03。

1.2 菌株的發(fā)酵及多糖的提取

將GHF11 接種到500 mL 的燒瓶中，每瓶150 mL，于115 ℃高壓滅菌30 min，并在28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)4 天。使用乙醇沉淀法從發(fā)酵液中提取胞外多糖粗品[7]，將培養(yǎng)液（6 L）高速離心除去菌體及代謝物，用旋轉蒸發(fā)器濃縮上清液至初始體積的1/10。濃縮液透析后，三倍體積的無水乙醇緩慢加入其中，充分混合后于4 ℃下放置過夜，離心收集產生的粗多糖沉淀物。將多糖重新溶解在去離子水中，等體積的Sevag 試劑（其為氯仿和正丁醇（4：1,V：V）的混合溶液）加入到粗多糖溶液中，充分混合，放置30 min，離心以除去其中蛋白質。將上層水相濃縮并凍干，得到脫蛋白粗多糖。

1.3 胞外多糖的純化

粗多糖的純化采用JIANG Changxing,et al[8]的方法并稍作修改。將粗多糖重新溶解于5.0 mL 去離子水中，上樣到DEAE-52 纖維素柱（2.5×30 cm），用0、0.1、0.3、0.5 mol·L-1的氯化鈉溶液以1.0 mL·min-1的流速梯度洗脫。用自動收集器以5 mL/管收集洗脫液。通過苯酚-硫酸法測定多糖，并繪制洗脫曲線[9]。合并相同組分，透析并濃縮。隨后，使用Sephadex G-100 凝膠滲透色譜柱（1.5×50 cm），用去離子水以0.2 mL·min-1的流速洗脫，進一步純化濃縮的組分，收集同一洗脫峰下的級分，濃縮凍干后得到多糖純品。

1.4 絮凝活性的測定

使用高嶺土懸濁液測定絮凝活性[10]。在250 mL 燒杯中依次加入93 mL 高嶺土懸濁液液（4 g·L-1），5 mL CaCl2（10 g·L-1）和2 mL 多糖溶液，調節(jié)pH 至7.5，將混合液在180 r·min-1下劇烈攪拌1.0 min，60 r·min-1下緩慢攪拌2.0 min，最后靜置10 min，用分光光度計測量上清液在550 nm 處的吸光度，使用2 mL 去離子水作為空白對照，所有操作平行3 次，絮凝率通過以下公式計算：

FR 代表絮凝率；A 和B 分別是對照和樣品的吸光度值。

1.5 脫色活性的測定

脫色活性的測定參照文獻[11]，脫色率表示為DC。對3 種染料進行脫色實驗，包括亞甲基藍，結晶紫和孔雀石綠。移取1 mL 的原液（400，400，1 000 mg·L-1），稀釋至100 mL，調節(jié)體系pH 7.5～8.0，加入1 mL樣品溶液，然后將混合物緩慢攪拌1 min 并靜置1 h，以9 000g 離心10 min，分別測量3 種稀釋溶液在660、580 和620 nm 處的吸光度，用去離子水作為參比。脫色活性計算公式如下：

其中DC 代表脫色率；A0和A 分別是對照和樣品的吸光度值。

1.6 單糖組成分析

利用HPLC 分析多糖的單糖組成，參考文獻[12]。將200 μL 多糖溶液（2g·L-1）和200 μL 三氟乙酸（2 mol·L-1）在安瓿瓶中混合于110 ℃水解4 h。安瓿瓶冷卻至室溫后，加入500 μL 甲醇并在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，重復加入3 次以除去殘留的三氟乙酸。然后將干燥的水解樣品溶解在200 μL 氫氧化鈉（0.3 mol·L-1）中，與200 μL PMP 甲醇溶液（0.5 mol·L-1）充分混合，在70 ℃下反應100 min。冷卻至室溫后，加入200 μL 鹽酸（0.3 mol·L-1）中和。隨后，加入二氯甲烷（1.0 mL）萃取數(shù)次以除去PMP。用0.45 μm 微孔濾膜過濾，用于HPLC 分析。同時，混合單糖標準品的衍生化過程在相同條件下進行。PMP 單糖衍生糖的分析在配備有光電二極管陣列檢測器（Agilent HP 1100，Agilent Technologies，USA）的HPLC 系統(tǒng)上操作。

色譜條件：色譜柱，Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；柱溫，30 ℃；流動相，磷酸鹽緩沖鹽（0.1 mol·L-1，pH 6.7），比例為17.8%（V/V%）乙腈；流速，1.0 mL·min-1；進樣量，20 μL；檢測器波長，254 nm。

1.7 紅外光譜分析和分子量測定

將純多糖（1 mg）與KBr（100 mg）充分混合并用紅外線干燥，然后用紅外光譜掃描儀BIO-RAD FTS3000在4 000cm-1～400 cm-1的范圍內掃描，掃描速率為1 cm-1。

通過凝膠滲透色譜柱HPSEC Shodex OH-park SB-805 測定多糖的分子量。色譜條件如下：柱溫，30 ℃；注射量：20 μL；流速：0.8 mL·min-1；通過標準曲線計算多糖分子量。

1.8 甲基化分析

使用HAKOMORI[13]的方法并稍做修改，對多糖進行甲基化分析。將多糖（1.0 mg）與1.0 mL DMSO 溶解在燒瓶中，快速加入100 mg 無水氫化鈉，并在室溫下磁力攪拌0.5 h。然后緩慢加入0.5 mL 碘甲烷，在室溫下磁力攪拌反應1.5 h，此過程在氮氣保護下避光反應。最后，加入1 mL 水終止反應，用二氯甲烷從溶液中萃取甲基化多糖3 次。合并萃取液后，用水洗滌二氯甲烷層3 次，減壓干燥二氯甲烷層，得到甲基化多糖。將甲基化多糖溶于0.5 mL 三氟乙酸（2 mol·L-1）中，并在安瓿瓶中于110 ℃密封水解4 h。待安瓿瓶冷卻后，開口加入甲醇（1 mL），蒸發(fā)至干，重復多次除去三氟乙酸，將水解的樣品并溶解在1 mL NaOH 溶液（0.05 mol·L-1）中，加入10 mg NaBH4，并在室溫下反應4 h，然后加入2 滴冰醋酸中和直至無氣泡產生，加入甲醇并蒸發(fā)至干多次以除去硼酸。將樣品干燥并轉移到EP 管中，加入0.5 mL 吡啶，將混合物在90 ℃水浴中密封0.5 h。冷卻后，加入0.5 mL 乙酸酐，將混合物在100 ℃水浴中密封1 h。最后，將乙酰化樣品在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，并溶于二氯甲烷（0.5 mL）中，并用水洗滌以除去不溶性鹽和吡啶。將溶液通過0.45 μm 鋁膜過濾，用于GC-MS 分析。

氣相質譜聯(lián)用儀條件：離子源溫度，260 ℃；進樣口溫度，240 ℃；初始溫度，60 ℃；程序升溫，3 ℃·min-1，240 ℃保溫10 min；色譜柱，DB-WAX（30 m×0.250 mm，0.50 μm，Agilent Technologies，USA）；檢測器溫度：250 ℃；氦氣流速，1.5 mL·min-1；進樣量，1.0 μL。

2 結果與分析

2.1 多糖的提取純化

使用sevag 試劑進行脫蛋白操作，從200～400 nm 的掃描結果如圖1A，在260 和280 nm 處沒有特征吸收，表明沒有蛋白質和核酸[14]。使用離子交換柱在水洗條件下洗脫出一個主要組分（圖1B），通過SephadexG-100 凝膠滲透色譜進一步純化顯示其為單一組分（圖1C）。純化的多糖用于進一步的活性分析和結構表征。

圖1 去蛋白后的F11 粗多糖紫外掃描曲線（200～400 nm）（A），F(xiàn)11 菌株胞外粗多糖經過DEAE-52 柱層析所得的洗脫曲線（B）；F11 菌株多糖過Sephadex G100 層析柱純化的洗脫曲線（C）Fig.1 Ultraviolet scanning of F11 polysaccharide at the wavelength of 200 to 400 nm（A）;elution curve of crude polysaccharide on DEAE-52 column（B）,and elution curves of polysaccharide fraction（C）on Sephadex G-100 column.

2.2 多糖活性測定

圖2A 顯示了多糖純品在去離子水系統(tǒng)中濃度從0.1 mg·L-1到1.0 mg·L-1的絮凝活性。實驗結果表明，在劑量為0.5 mg·L-1時，最大絮凝率達到71.2%，在較少或較高劑量下絮凝活性逐漸降低。圖2B 顯示了多糖劑量范圍為0.5～3.0 mg·L-1時，對于孔雀石綠的脫色效果變化曲線，在反應劑量1.8 mg·L-1時，達到最佳脫色效果92.4%。當劑量小于0.5 mg·L-1或超過3.0 mg·L-1時，脫色率顯著下降。

圖2 多糖劑量對絮凝率及脫色活性的影響Fig.2 The effect of F11 polysaccharide dosage on flocculation rate and decolorization activity

2.3 紅外光譜分析

純多糖的組成包括葡萄糖，甘露糖，葡糖胺，核糖和半乳糖。葡萄糖和甘露糖占主要比例，這意味著葡萄糖可能是微生物絮凝劑的基本骨架。核糖，葡糖胺和半乳糖可以是多糖的分支結構。

多糖的分子量確定為約31 kDa。如圖3 所示，在400 和4 000 cm-1之間掃描純化的多糖以分析FT-IR光譜。在3 432 cm-1處的強吸收峰證實了羥基的存在。1 393 cm-1和1 641 cm-1處的吸收峰是羧酸鹽基團的C=O 不對稱和對稱伸縮振動的特征[15]。在1 111cm-1處觀察到的強峰表明糖環(huán)的C-O-C 伸縮振動，也是糖衍生物的典型特征[16]。生物絮凝劑中羥基，羧基和羰基的存在可以改善生物絮凝劑中的結合能力。

圖3 F11 菌株胞外多糖的紅外光譜圖Fig.3 The infrared spectrogram of F11 polysaccharide

2.4 多糖的單糖組成及分子量

反相HPLC 的結果（圖4）表明多糖是一種雜多糖，其質量比由Man，GlcN，Rib，Gal 和Glc 組成，如表1所示。很明顯葡萄糖是含量最多的單糖，甘露糖的比例小于葡萄糖，其余組分如GlcN，Rib，Gal 可忽略不計。在所有單糖組成中，中性糖（包括D-甘露糖，D-葡萄糖D-核糖和D-半乳糖）占多糖的總質量比例為97.8%，而氨基糖（GlcN）僅占2.2%，糖醛酸含量可以忽略不計。

表1 多糖的各單糖組成比例Tab.1 Monosaccharide composition of polysaccharide

圖4 各單糖混合標準品液相色譜圖（A），F(xiàn)11 菌株胞外多糖PMP 衍生物液相色譜圖（B）Fig.4 HPLC chromatograms of PMP derivatives of standard monosaccharides（A）;hydrolyzed monosaccharides derivatives from F11polysaccharide（B）

2.5 甲基化分析

由于復雜的組成和特定的分子量，該多糖絮凝劑有著特殊的結構[17-18]。多糖是微生物分泌的胞外物質的主要成分，胞外多糖的研究有著重要的意義，然而，關于微生物胞外多糖絮凝劑分子結構研究很少，揭示絮凝機制與多糖分子結構的聯(lián)系，仍然需要進一步的研究。

通過GC-MS 分析，獲得質譜（圖5）。與標準質譜相比，連接方式由葡萄糖1→2→3→4 連接，甘露糖1→2→3→4→6 連接組成。取代的羥基越多，分支越多。結合紅外掃描，可以發(fā)現(xiàn)圖4 中顯示的羥基吸收峰較弱，C-O-C 成環(huán)骨架的吸收峰較強，與甲基化分析中的連接方式相吻合。

圖5 F11 胞外多糖衍生物質譜圖Fig.5 Mass spectrum of derivative extracellular polysaccharideof F11

2.6 多糖的絮凝機制

馬尼拉貝黏附污泥可用作絮凝資源，從微生物中提取胞外多糖的研究很多[1,4,17,19-21]。胞外多糖是由微生物分泌的，因此絮凝活性的產生與粘性泥漿中的微生物群落有關。

廣泛接受的絮凝機制主要包括壓縮雙電層、電性中和、架橋和網捕卷掃等假設[22-23]。然而，絮凝機制不僅是一種機制的功能，而是多種機制相互協(xié)同作用的結果。通過GC-MS 分析，糖苷鍵連接方式由葡萄糖1→2→3→4 連接，甘露糖1→2→3→4→6 連接組成。結合紅外光譜中的較弱羥基峰，多糖具有多支鏈網絡結構，多糖的多支鏈結構可促進其與懸浮顆粒的結合，實現(xiàn)沉降效果，這與網捕卷掃機制類似。

3 結論

在該研究中，從菌株F11 的發(fā)酵液中純化出一種新型胞外多糖，可用作微生物絮凝劑，并通過GCMS，F(xiàn)T-IR，HPLC 分析方法表征胞外多糖。結果表明，微生物胞外多糖由72.6%葡萄糖和17.6%甘露糖組成。其分子量為31 kDa。高度支化的結構表明對絮凝和脫色有顯著影響。在去離子水系統(tǒng)中，對高嶺土的絮凝率達到71.3%，對孔雀石綠的脫色率為92.4%。較高的脫色率使其在未來水處理中有巨大的應用前景。絮凝過程有著復雜的機制，為了掌握分子結構和多糖性質之間的關系，需要進一步的深入研究。