姚 亮，唐若愚，尹 嵐，陳小平

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)遭受蠕蟲類寄生蟲如日本血吸蟲感染或經(jīng)過敏原刺激后,其初始輔助Th細(xì)胞被激活并向Th2細(xì)胞分化。Th2細(xì)胞分泌的IL-4促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，可使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生脫顆粒反應(yīng)；分泌的IL-5可激活嗜酸性粒細(xì)胞；分泌的IL-13可刺激黏膜上皮細(xì)胞增生及分泌黏液增多。這些反應(yīng)構(gòu)成Th2型免疫應(yīng)答，利于機(jī)體將寄生蟲或過敏原排出體外，但也可能導(dǎo)致過敏性疾病及器官纖維化[1-3]。遍布全身的經(jīng)典抗原提呈細(xì)胞—樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)在激活和極化Th2中起決定性作用[4-5]。此外，嗜堿性粒細(xì)胞通過持續(xù)大量產(chǎn)生IL-4也起著重要輔助作用[6-7]。嗜堿性粒細(xì)胞由骨髓干細(xì)胞在IL-3或胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)的作用下分化而成，但此過程是否受到IL-4調(diào)節(jié)尚不清楚。本研究通過比較IL-4缺陷小鼠和野生型小鼠骨髓細(xì)胞受IL-3誘導(dǎo)分化為嗜堿性粒細(xì)胞的情況，探究IL-4對嗜堿性粒細(xì)胞分化及維持的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司和上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；IL-4基因缺陷小鼠(IL-4 knock out，IL-4 KO)(存儲(chǔ)號：002496)購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。小鼠在同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、RPMI-1640液體培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(P/S)購自美國Gibco公司；PBS購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；重組小鼠細(xì)胞因子IL-3、IL-4購自美國Peprotech公司；Anti-IL-4(11B11)購自美國Biolegend公司。

流式細(xì)胞染色抗體及試劑：APC標(biāo)記的抗小鼠FcεRIα(MAR-1)、PE以及FITC標(biāo)記的抗小鼠ckit(2B8)、PE-cy7標(biāo)記的抗小鼠CD49b(DX5)、BV421標(biāo)記的抗小鼠CD11c(N418)、PE標(biāo)記的抗小鼠Ki67(16A8)。以上抗體及相應(yīng)的同型對照抗體均購自美國Biolegend公司。Permeabilization Buffer(10×)、Fixation/Permeabilization Diluent、Fixation/Permeab-ilization Concentrate均購自美國eBioscience公司。ELISA試劑：Purified抗小鼠IL-4(554434)與Biotin標(biāo)記抗小鼠IL-4(554390)均購自美國BD公司；細(xì)胞因子IL-4標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Peprotech公司；Avidin-HRP購自美國BioLegend公司；顯色液TMB購自碧云天生物技術(shù)有限公司；包被液：將1.59 g碳酸鈉及2.93 g碳酸氫鈉溶于1 000 mL 水中，并將pH值調(diào)至9.6；洗滌液PBST：含有0.05% Tween-20的PBS；封閉液：含5%BSA的PBS溶液；終止液：1 mol/L硫酸溶液。

1.3 方法

1.3.1 骨髓來源的嗜堿性粒細(xì)胞培養(yǎng) 6～8周野生型或IL-4缺陷型雌性小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后脫頸處死，無菌環(huán)境下取出股骨及脛骨。沖洗出骨髓腔中骨髓細(xì)胞并重懸于RPMI-1640中，離心半徑16.1 cm，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀分散后重懸于2 mL紅細(xì)胞裂解液中1 min，加入RPMI-1640培養(yǎng)基終止裂解。離心半徑16.1 cm，1 500 r/min，離心5 min ，棄上清液，加入含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整密度至1×106/mL。接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，并加入終濃度為25 ng/mL的細(xì)胞因子IL-3；每隔3 d進(jìn)行1次換液。培養(yǎng)過程中，于第3、6、9、12天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.2 細(xì)胞分選及其培養(yǎng) 經(jīng)1.3培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞，在所示天數(shù)收集細(xì)胞，離心半徑16.1 cm，1 500 r/min ，離心5 min，RPMI-1640洗滌后，加入封閉血清和APC標(biāo)記抗小鼠FcεRIα、PE標(biāo)記抗小鼠ckit、PE-cy7標(biāo)記抗小鼠CD49b。4 ℃避光孵育30 min。RPMI-1640重懸后離心，再重懸于RPMI-1640中，使用BD FCASAria Ⅲ細(xì)胞分選儀器分選FcεRIα+ckit-CD49b-單陽細(xì)胞群。分選后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種至24孔板中，分別在加入IL-3(30 ng/mL)后的第1、2、3天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.3 流式細(xì)胞染色 膜分子染色：將IL-3刺激培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)移至流式管中，4 ℃，離心半徑16.1 cm，1 500 r/min，離心5 min。棄上清液，加入0.8 mL預(yù)冷的FACS Buffer(含10%FBS和0.1%NaN3的PBS)，混勻。再次離心后加入與抗體同體積的小鼠血清進(jìn)行封閉，加入相應(yīng)體積的APC標(biāo)記的抗小鼠FcεRIα，PE或FITC標(biāo)記的抗小鼠ckit，BV421標(biāo)記的抗小鼠CD11c，PE-cy7標(biāo)記的抗小鼠CD49b，4 ℃避光孵育30 min。加入0.8 mL FACS Buffer重懸后離心，細(xì)胞沉淀重懸于200 μL Fix Buffer(含1%多聚甲醛的FACS Buffer)重懸細(xì)胞，經(jīng)200目尼龍篩網(wǎng)過濾后，BD FACS Verse儀器上檢測，使用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行分析。

胞內(nèi)分子染色：膜分子染色完畢后，細(xì)胞重懸于200 μL Fixation/Permeabilization，4 ℃避光孵育45 min。離心，加入200 μL 1× Permeabilization Buffer工作液，重懸后離心。重復(fù)上一步操作后，加入1× Permeabilization Buffer工作液使總體積達(dá)100 μL。加入2 μL小鼠血清，室溫避光孵育15 min。加入1 μL PE標(biāo)記的抗小鼠Ki67抗體，室溫避光孵育30 min。加入200 μL 1× Permeabilization Buffer工作液，混懸，離心棄上清液。重復(fù)上一步操作，加入200 μL Fix Buffer重懸細(xì)胞，經(jīng)200目尼龍篩網(wǎng)過濾后，BD FACS Verse儀器上檢測，使用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 日本血吸蟲感染模型的建立 選用6～8周雌性BALB/c 15只、雌性IL-4 KO小鼠15只，腹部皮膚脫毛，暴露于30條日本血吸蟲尾蚴20 min。其中，日本血吸蟲蟲株為安徽貴池株，尾蚴由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲預(yù)防控制所提供。

感染后小鼠飼養(yǎng)于清潔級鼠房，待感染7周后各隨機(jī)選取5只處死，流式細(xì)胞染色法檢測骨髓中嗜堿性粒細(xì)胞(FcεRIα+ckit-CD49b+)。

1.3.5 IL-4細(xì)胞因子檢測 使用ELISA包被液稀釋Purified抗小鼠IL-4，100 μL每孔包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜。PBST洗滌5次后，每孔加入200 μL含5%BSA封閉液，37 ℃放置1 h。PBST洗滌5次，使用1%BSA稀釋IL-4標(biāo)準(zhǔn)品以及野生型小鼠骨髓細(xì)胞上清液后，每孔100 μL，設(shè)2個(gè)副孔，37 ℃放置2 h。PBST洗滌5次，加入Biotin標(biāo)記抗小鼠IL-4，100 μL每孔，37 ℃放置1 h。PBST洗滌5次，加入100 μL的avidin-HRP，37 ℃放置30 min。PBST洗滌5次，加入100 μL TMB顯色液，室溫避光孵育15 min 后，加入50 μL 終止液終止顯色。酶標(biāo)儀測450 nm波長下的吸光度值(A450)，根據(jù)曲線計(jì)算上清液的IL-4濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IL-4缺陷小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)IL-3誘導(dǎo)產(chǎn)生更多嗜堿性粒細(xì)胞

IL-3是誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為嗜堿性粒細(xì)胞的最主要細(xì)胞因子[8]。骨髓細(xì)胞在IL-3作用下，誘導(dǎo)出FcεRIα+ckit-CD49b+嗜堿性粒細(xì)胞和FcεRIα+ckit+CD49b-的肥大細(xì)胞，見圖1A，其中FcεRIα是IgEFc段的高親和力受體，該受體被交聯(lián)后使嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞激活而發(fā)生脫顆粒反應(yīng)[9]。IL-3也可以誘導(dǎo)CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞[10]。經(jīng)IL-3培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞，3～4 d后開始有嗜堿性粒細(xì)胞出現(xiàn)，至第9天達(dá)到高峰，以后開始下降。與野生型相比，IL-4缺陷型骨髓誘導(dǎo)出的嗜堿性粒細(xì)胞，無論是在細(xì)胞比例或數(shù)目上，還是細(xì)胞表達(dá)FcεRIα的平均熒光強(qiáng)度都有增加，尤以第4、12天顯著，見圖 1B～D。此外，與野生型相比，IL-4缺陷型骨髓細(xì)胞被IL-3誘導(dǎo)出的CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞群的比例卻顯著降低，與FcεRIα陽性細(xì)胞的增加呈反向關(guān)系，見圖1E。

為進(jìn)一步明確在體IL-4對嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生的影響，本研究于穩(wěn)態(tài)下檢測了野生型小鼠及IL-4缺陷小鼠外周血及骨髓中嗜堿性粒細(xì)胞分布，如圖1F所示，未感染狀態(tài)下二者嗜堿性粒細(xì)胞無論是在骨髓抑或是外周血(數(shù)據(jù)未顯示)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)而，本研究選擇了廣泛使用的研究Th2免疫應(yīng)答模型：日本血吸蟲感染模型。感染7周后，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠骨髓中細(xì)胞群分布，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，IL-4缺陷鼠嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞群比例顯著提高，見圖1F。

圖1 IL-4敲除鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)IL-3誘導(dǎo)產(chǎn)生的嗜堿性粒細(xì)胞顯著性增加Fig.1 The production of basophils from BM of IL-4-/- mice was significantly increased with treatment of IL-3A：代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測嗜堿性粒細(xì)胞設(shè)門過程(FcεRIα+ckit-CD49b+)；B、C、D：3只鼠骨髓細(xì)胞刺激后不同時(shí)間點(diǎn)嗜堿性粒細(xì)胞比例、數(shù)目和FcεRIα的平均熒光強(qiáng)度；E：3只鼠骨髓細(xì)胞刺激后不同時(shí)間點(diǎn)CD11c陽性細(xì)胞比例；F：取未經(jīng)感染的野生型及IL-4缺陷鼠(各3只)骨髓，破除紅細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)態(tài)下骨髓中嗜堿性粒細(xì)胞比例；日本血吸蟲尾蚴感染野生型及IL-4缺陷鼠(30條/只；各5只)，感染7周后流式細(xì)胞術(shù)檢測二者骨髓中嗜堿性細(xì)胞比例；非配對t檢驗(yàn)分析，*P<0.05，**P<0.01；所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次

2.2 IL-4具有下調(diào)IL-3誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生的作用

與報(bào)道一致，經(jīng)IL-3誘導(dǎo)分化出的嗜堿性粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-4(數(shù)據(jù)未顯示)。為明確IL-4缺陷鼠中表現(xiàn)出的嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生增加是否歸因于IL-4，在IL-4缺陷型小鼠骨髓的IL-3誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中加入重組IL-4。與對照組PBS相比，外源性IL-4使得IL-4缺陷型小鼠骨髓嗜堿性粒細(xì)胞生成和FcεRIα表達(dá)均被顯著抑制，見圖2A、B。在野生型小鼠骨髓IL-3誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，分別加入Anti-IL-4抗體并與同型抗體對照。加入Anti-IL-4使野生型小鼠骨髓誘導(dǎo)第9天后產(chǎn)生更多的嗜堿性粒細(xì)胞，且該細(xì)胞群的FcεRIα平均熒光強(qiáng)度也顯著性增加，見圖2C、D。本研究在野生型小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)體系上清液中檢測出了細(xì)胞因子IL-4，且自始至終均存在于培養(yǎng)體系中，見圖2E。因此，IL-3誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化第9天即大量出現(xiàn)成熟嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞時(shí)，有IL-4產(chǎn)生，且該IL-4具有控制嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量的作用。CD11c+細(xì)胞群形成與嗜堿性粒細(xì)胞群也呈反向關(guān)系。加入Anti-IL-4后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD11c+細(xì)胞群比例顯著性降低；然而加入外源性IL-4后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD11c+細(xì)胞群比例顯著性升高，見圖2F、G。

圖2 IL-4下調(diào)IL-3誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞的產(chǎn)生Fig.2 IL-4 inhibits the production of basophils derived from IL-3 treated bone marrow cellsA～C：IL-3(25 ng/mL)聯(lián)合IL-4(5 ng/mL)或PBS刺激IL-4缺陷型小鼠骨髓細(xì)胞;A：流 式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b+細(xì)胞群比例；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b+細(xì)胞群的FcεRIα平均熒光強(qiáng)度；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b+細(xì)胞群比例；D～F：IL-3(25 ng/mL)聯(lián)合Anti-IL-4(10 ng/mL)或同型對照抗體刺激野生型小鼠骨髓細(xì)胞;D：流式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b+細(xì)胞群的FcεRIα平均熒光強(qiáng)度；E：IL-3(25 ng/mL)刺激野生型小鼠骨髓細(xì)胞，ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-4；F：流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11c+的比例；G：流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11c+細(xì)胞群比例；非配對t檢驗(yàn)分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次

2.3 與野生型相比，IL-4缺陷小鼠嗜堿性粒細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖增加

已有研究報(bào)道顯示，從骨髓干細(xì)胞發(fā)育成嗜堿性粒細(xì)胞的定向干細(xì)胞或前體細(xì)胞包括嗜堿性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞共同前體細(xì)胞Pre-BMP(Lin-Sca1-ckit+CD34+CD16/32+FcεRIα+)，以及稍晚的嗜堿性粒細(xì)胞前體細(xì)胞BaP(Lin-CD34+FcεRIα+ckit-)[11-12]。為探究IL-4缺陷鼠的嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生增加是否歸因于這2種前體細(xì)胞的改變，本研究比較了野生型及IL-4缺陷小鼠骨髓細(xì)胞在IL-3誘導(dǎo)分化過程中Pre-BMP及BaP細(xì)胞群的比例，見圖3A、B。與報(bào)道一致，這2類前體細(xì)胞群比例始終處于極低水平，不超過總細(xì)胞數(shù)的萬分之一[11-13]。野生型對照組和IL-4缺陷組中Pre-BMP的比例均在IL-3誘導(dǎo)后第1天達(dá)到峰值，此后隨時(shí)間推移而下降；BaP的比例則在誘導(dǎo)后第3天達(dá)到峰值，此后下降。野生型和IL-4缺陷組的Pre-BMP和BaP比例均僅在第9天有顯著差異，但此時(shí)兩組比例都極低(接近于0)，且IL-4缺陷組的BaP比例是顯著性低于野生型對照組的。兼之IL-4缺陷所導(dǎo)致的嗜堿性粒細(xì)胞比例顯著性增高始于IL-3誘導(dǎo)后第6天，見圖1。故可認(rèn)為IL-4缺陷所導(dǎo)致的嗜堿性粒細(xì)胞增加并非是由已知的嗜堿性粒細(xì)胞前體增加所致。

進(jìn)而利用Ki67染色，探究IL-4缺陷對分化出的相關(guān)細(xì)胞群增殖狀態(tài)的影響。如圖3C所示，野生型小鼠經(jīng)骨髓分化而來的FcεRIα+ckit-CD49b+成熟嗜堿性粒細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的比例不超過15%，以誘導(dǎo)4～6 d最高，后隨檢測時(shí)間點(diǎn)逐漸下降。而IL-4缺陷鼠中處于增殖狀態(tài)的成熟嗜堿性粒細(xì)胞的比例，在最高點(diǎn)即第9天明顯高于野生型，且該顯著增加的趨勢一直維持到檢測后期，見圖3C。此外，本研究注意到一群接近全增殖狀態(tài)的僅僅表達(dá)FcεRIα而ckit和CD49b為陰性的單陽細(xì)胞群。與野生型相比，IL-4缺陷小鼠單陽細(xì)胞群Ki67陽性率下降趨勢顯著放緩，且一直維持在較高水平，見圖3D。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，單陽細(xì)胞群在骨髓細(xì)胞里的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前已知的嗜堿性粒細(xì)胞前體細(xì)胞所占的比例，大概高100倍。和嗜堿性粒細(xì)胞一樣，單陽性細(xì)胞比例亦隨IL-3誘導(dǎo)而增加，并于第6天達(dá)到峰值，此后下降。并且，與嗜堿性粒細(xì)胞的變化一致，IL-4缺陷小鼠中單陽細(xì)胞比例也顯著高于野生型鼠，見圖3E。從表型上看(數(shù)據(jù)未顯示)，這群細(xì)胞不是肥大細(xì)胞或Pre-BMP細(xì)胞(無ckit)，不是BaP細(xì)胞(無CD34)，不是嗜酸性粒細(xì)胞(無siglec-F)，但CD11b和Ly-6G陽性，屬粒細(xì)胞系。更重要的是，流式分選出的單陽細(xì)胞群，經(jīng)IL-3刺激培養(yǎng)，可繼續(xù)分化成嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，見圖3F，但其分化能力在野生型與IL-4缺陷型之間無差異(數(shù)據(jù)未顯示)。上述結(jié)果提示，IL-4缺陷小鼠嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生增加可能是由于嗜堿性粒細(xì)胞增殖能力增加以及其單陽前體細(xì)胞數(shù)量和增殖能力增加所致。

圖3 IL-4缺陷鼠單陽細(xì)胞增殖增加Fig.3 Basophils and FcεRIα single-positive precursor cells from IL-4 deficiency mice displayed more proliferation capacityA、B：IL-3(25 ng/mL)刺激野生型及IL-4缺陷型小鼠骨髓細(xì)胞；A：流式細(xì)胞術(shù)檢測Pre-BMP(Lin-Sca1-ckit+CD34+CD16/32+FcεRIα+)比例；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測BaP(Lin-CD34+FcεRIα+ckit-)比例；C、D：IL-3(25 ng/mL)刺激野生型及IL-4缺陷型小鼠骨髓細(xì)胞；C：流 式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b+嗜堿性粒細(xì)胞的Ki67陽性率；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b-單陽細(xì)胞群的Ki67陽性率；E：IL-3(25 ng/mL)刺激來自野生型及IL-4缺陷型各3只小鼠的骨髓細(xì)胞，于培養(yǎng)后0、4、6、9、12 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測FcεRIα+ckit-CD49b-單陽細(xì)胞群比例；F：IL-3(30 ng/mL)誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓細(xì)胞7 d后，代表性流式細(xì)胞分選單陽性細(xì)胞設(shè)門過程(FcεRIα+ckit-CD49b-)；經(jīng)IL-3(30 ng/mL)繼續(xù)刺激培養(yǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測該細(xì)胞群分化情況；非配對t檢驗(yàn)分析，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

盡管早在1879年P(guān)aul Ehrlich就發(fā)現(xiàn)一類容易被堿性染料著色而被命名為嗜堿性粒細(xì)胞的血細(xì)胞，但由于它在外周血中的比例極低(低于1%)，研究手段有限，所以它的作用一直不清楚。直到1970年代，研究者發(fā)現(xiàn)人嗜堿性粒細(xì)胞和組織里的肥大細(xì)胞一樣，表達(dá)IgE高親和力受體，該受體也可被過敏原交聯(lián)激活導(dǎo)致脫顆粒反應(yīng)釋放組胺和組織水解酶及炎癥介質(zhì)[14]。在小鼠中開展的研究工作發(fā)現(xiàn)，這類粒細(xì)胞在過敏和蠕蟲感染時(shí)不僅數(shù)目增加，還可浸潤組織，持續(xù)產(chǎn)生大量IL-4，與Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞ILC2和Th2細(xì)胞一起，在過敏和抗蠕蟲類寄生蟲感染的Ⅱ型免疫應(yīng)答中起著效應(yīng)和調(diào)節(jié)作用[15]。但是與其他骨髓來源的外周血細(xì)胞相比，對調(diào)節(jié)其產(chǎn)生和維持的機(jī)制尚不十分清楚。

正常情況下，嗜堿性粒細(xì)胞由多能自我更新能力強(qiáng)的骨髓干細(xì)胞經(jīng)自我更新能力弱的定向干細(xì)胞在骨髓中完成分化和成熟。在這個(gè)過程中，細(xì)胞因子IL-3和TSLP具有各自獨(dú)立刺激前體細(xì)胞定向分化為嗜堿性粒細(xì)胞的能力[16]，伴有骨髓細(xì)胞干性標(biāo)志分子CD34轉(zhuǎn)陰，肥大細(xì)胞標(biāo)志分子ckit轉(zhuǎn)陰，IgE高親和力受體FcεRIα轉(zhuǎn)陽及嗜堿性粒細(xì)胞成熟標(biāo)志分子整合素CD49b轉(zhuǎn)陽[17]。pre-BMP(Lin-Sca1-ckit+CD34+CD16/32+FcεRIα+)以及稍晚的前體BaP(Lin-CD34+FcεRIα+ckit-)是2種已經(jīng)闡明的嗜堿性粒細(xì)胞的定向干細(xì)胞，IL-3通過激活STAT5啟動(dòng)核因子GATA2調(diào)控Pre-BMP和BaP的產(chǎn)生及進(jìn)一步分化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IL-3誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞定向分化過程中，存在FcεRIα+ckit-CD49b-的單陽細(xì)胞。重要的是，這類單陽細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2類定向干細(xì)胞，且具有繼續(xù)分化為成熟嗜堿性粒細(xì)胞的能力。日本血吸蟲感染小鼠脾臟及肝臟中也發(fā)現(xiàn)，單陽細(xì)胞也和嗜堿性粒細(xì)胞一樣具有浸潤能力。因此，在定向干細(xì)胞之后至成熟之前，嗜堿性粒細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)具有增殖能力但尚未完全成熟的過渡階段，而IL-4通過抑制這些細(xì)胞的增殖而限制嗜堿性粒細(xì)胞的產(chǎn)生。

IL-3通過其異源二聚體受體復(fù)合物的信號級聯(lián)反應(yīng)促使定向干細(xì)胞向嗜堿性粒細(xì)胞分化，并維持嗜堿性粒細(xì)胞的生存和增殖。異源二聚體包括與IL-5和GM-CSF共用的負(fù)責(zé)傳遞信號的共有β鏈(βc)，及與各自細(xì)胞因子特異性結(jié)合的α鏈。小鼠還有另一個(gè)β鏈叫βcIL-3,與共有β鏈具有91%相似性[18]。βc-JAK2-STAT5-GATA2的級聯(lián)激活在嗜堿性粒細(xì)胞定向分化中起著決定性作用，而通過胞質(zhì)內(nèi)伴侶蛋白14-3-3招募介導(dǎo)及激活PI3K和AKT則在細(xì)胞生存(抗凋亡)和增殖中起著重要作用[19]。最近研究顯示，IL-4和IL-3一樣，通過PI3K，抑制成熟嗜堿性粒細(xì)胞凋亡[20]，而本研究則發(fā)現(xiàn)IL-4 抑制了IL-3對成熟嗜堿性粒細(xì)胞和即將成熟的單陽細(xì)胞的促增殖作用，但對凋亡無影響(數(shù)據(jù)未顯示)。不可否認(rèn)，在IL-3誘導(dǎo)分化過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性IL-4可在多環(huán)節(jié)行使調(diào)節(jié)作用，但已報(bào)道的抗凋亡作用，無法解釋本研究觀察到的IL-4缺陷小鼠骨髓細(xì)胞能被IL-3誘導(dǎo)出更多的嗜堿性粒細(xì)胞的現(xiàn)象。已往的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)IL-4抑制嗜堿性粒細(xì)胞中免疫細(xì)胞srk激酶家族分子lyn的激活，由于lyn可對IL-3活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用[21]，不能排除該作用可能參與介導(dǎo)IL-4缺陷小鼠中IL-3誘導(dǎo)增殖的活性增加。因此，本課題組將在本實(shí)驗(yàn)體系下檢測IL-4缺陷型骨髓細(xì)胞經(jīng)IL-3誘導(dǎo)后lyn磷酸化水平的變化。此外，為探究“單陽性細(xì)胞”及嗜堿性粒細(xì)胞增殖能力具體如何被IL-4影響，后續(xù)會(huì)將兩細(xì)胞群進(jìn)行RNA測序，以檢測何種信號分子受到IL-4影響而致使增殖能力發(fā)生變化。

嗜堿性粒細(xì)胞的顆粒小體中，除含組胺及各種組織水解酶，含大量的IL-4，因而嗜堿性粒細(xì)胞也參與啟動(dòng)Th2適應(yīng)性免疫應(yīng)答[22]。本研究中IL-4通過下調(diào)成熟和將要成熟的嗜堿性粒細(xì)胞增殖而限制嗜堿性粒細(xì)胞的過度產(chǎn)生，對Th2應(yīng)答及其主導(dǎo)的過敏反應(yīng)起到了負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。本研究認(rèn)為，在Th2應(yīng)答的啟動(dòng)階段，嗜堿性粒細(xì)胞作為IL-4的主要來源而通過IL-4-STAT6信號通路發(fā)揮重要作用；而在Th2應(yīng)答的效應(yīng)階段，Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量的IL-4從而致使B細(xì)胞進(jìn)行抗體類別轉(zhuǎn)換分泌出IgE的同時(shí)，上調(diào)的IL-4水平能夠抑制Ⅱ型免疫應(yīng)答效應(yīng)細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞的產(chǎn)生。通過這些調(diào)節(jié)機(jī)制，機(jī)體從而能夠?qū)h2應(yīng)答控制在一定水平。因此僅僅干預(yù)IL-4的作用可能不是控制過敏性疾病的合理選擇。