孫 欣，袁業(yè)鋒，李海雁，馮雅琴

(1山西醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，山西 太原 030001；2首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京兒童醫(yī)院， 北京 100045)

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是動物體內(nèi)外幾乎所有細胞均可釋放的膜性小泡，攜帶有多種蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等分子，可以靶向運輸給受體細胞，改變受體細胞的功能[1-2]。目前認為EVs主要包括外泌體(exosomes)和微泡(microvesicles，MVs)。外泌體是由細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合后，將多泡體腔內(nèi)小泡釋放至細胞外而形成的，直徑在40～150 nm；微泡是細胞以出芽方式脫落至細胞外的小泡，直徑在50～1 000 nm。外泌體和微泡雖然發(fā)生方式不同，但其大小、形態(tài)及內(nèi)容物相近，目前富集囊泡的方法很難將二者嚴格分開[3]。EVs廣泛存在于多種體液中，因容易獲得且能攜帶來源細胞的特異分子，所以在疾病的發(fā)病機制研究及診斷治療方面有重要的價值[2-3]。

近幾年，有關(guān)精液EVs在精子發(fā)育成熟方面的作用研究越來越多。精子在睪丸中生成，離開睪丸后功能進一步成熟。精子形成后基本失去蛋白合成功能，所以精子與精子外蛋白分子之間的相互作用就顯得非常重要，而精液EVs是精子外蛋白分子的重要提供者[2,4-5]。精液EVs主要來源于睪丸、附睪、前列腺等器官[6]。目前對睪丸組織EVs的研究報道較少。附睪組織EVs又稱附睪小體(epididymosomes)，主要由附睪上皮細胞通過頂漿分泌釋放到附睪腔中[4]。 精子在附睪中貯存時間較長，期間獲得向前運動能力和受精潛能，所以精子通過與附睪小體之間的相互作用獲得成熟所需的分子顯得尤為重要，相關(guān)研究報道也較多[5,7]。 前列腺組織EVs又稱前列腺小體(prostasomes)，主要來源于腺上皮細胞中的多泡體，在調(diào)節(jié)精子活力、防止過早或自發(fā)的頂體反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用[5,8]。在體外培養(yǎng)的微酸性環(huán)境中，精子與前列腺小體融合，可使精子細胞膜的流動性下降[7-9]。因此，前列腺組織EVs功能破壞可能會導(dǎo)致生育能力下降。

目前，有關(guān)精液EVs的研究多集中在牛、羊等動物和人類上[10-13]，而對于小鼠這種模式生物的報道相對較少。因此，本試驗以小鼠為研究對象，分別富集其睪丸、附睪和前列腺組織的EVs，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析3種EVs的蛋白質(zhì)組分，并進行GO(gene ontology)富集分析，旨在了解睪丸、附睪和前列腺組織EVs的蛋白成分及其可能的功能，為通過精液總的EVs分析來推斷EVs來源器官的功能是否正常及體外精子保存提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

健康成年雄性C57BL/6J小鼠，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物中心飼養(yǎng)(合格證號:KYD2005-006)。Total Exosome Isolation(from other body fluids)，為invitrogen公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，為Biotopped公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail，PI)，為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；兔Calnexin抗體，為abcam公司產(chǎn)品；小鼠CD63抗體，為BD公司產(chǎn)品；兔TSG101抗體，為ABclonal公司產(chǎn)品；各種HRP標(biāo)記的二抗，均為中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乙酸雙氧鈾，為上海吉至生化科技有限公司產(chǎn)品。透射電子顯微鏡(日本JEOL公司，JEM-1400)，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所分子發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室細胞生物學(xué)平臺提供；動態(tài)光散射粒徑分析儀(英國馬爾文公司，Nano ZS90)，由中國科學(xué)院高能物理研究所提供；質(zhì)譜檢測所用試劑、儀器，均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 EVs的分離與純化

本研究中所有試驗方案均經(jīng)中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。采用總外泌體分離試劑盒(total exosome isolation，TEI)分離小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs。取成年(3～4月齡)健康雄性C57BL/6J小鼠，用CO2麻醉后迅速取睪丸、附睪和前列腺組織，在4 ℃預(yù)冷的PBS中漂洗以減少血液污染，睪丸去掉白膜。更換新鮮PBS，用眼科剪將每種組織剪成2～6塊，使用巴氏吸管輕柔地將組織吹散開。收集組織懸液，4 ℃下2 000g離心30 min，將上清移到新的EP管中，4 ℃下10 000g離心30 min，再將所得上清移到新的EP管中，加入0.2倍上清體積的TEI分離試劑，室溫靜置30 min，4 ℃下10 000g離心1 h，棄上清，沉淀即為EVs，重懸備用。單次試驗收集睪丸組織EVs需1只雄鼠，附睪組織EVs需3只雄鼠，前列腺組織EVs需7只雄鼠，試驗重復(fù)3次。

1.3 EVs的鑒定

分化抗原63(cluster differentiation antigen 63，CD63)是一種4次跨膜的蛋白，是外泌體的一種常用標(biāo)記蛋白；腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)也是外泌體的一種常見標(biāo)記蛋白，也可作為arrestin結(jié)構(gòu)域蛋白1(arrestin domain-containing protein 1，ARRDC1)介導(dǎo)的微泡的一種標(biāo)記物[14]。鈣聯(lián)結(jié)蛋白(calnexin)則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種標(biāo)記蛋白，經(jīng)常作為外泌體純化的陰性對照。

用免疫印跡對分離的EVs進行鑒定。向睪丸、附睪、前列腺組織及其EVs中分別加入RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，10 g/L NP-40，5 g/L脫氧膽酸鈉，1 g/L SDS)，RIPA裂解液使用前加體積分數(shù)1%的PI(成分為AEBSF、抑肽酶、烏苯美司、E-64、亮抑酶肽和抑肽素A)，組織用超聲研磨儀研磨1 min，直至無肉眼可見的組織碎塊，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清；EVs與裂解液混勻冰上靜置20 min。測蛋白濃度，加入6×loading，97 ℃變性20 min，備用。對上述組織和EVs樣品進行12% SDS-PAGE電泳，組織蛋白上樣量10 μg，EVs蛋白上樣量30 μg。電泳結(jié)束后95 V轉(zhuǎn)膜2 h，30 g/L BSA封閉2 h，4 ℃下用一抗(Calnexin、CD63和TSG101抗體，其稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)孵育過夜，室溫下用二抗(1∶5 000稀釋)孵育1.5 h，ECL發(fā)光，曝光觀察。試驗重復(fù)3次。

1.4 EVs的透射電鏡觀察

將8 μL EVs的PBS懸液(睪丸和附睪組織EVs用140 μL PBS重懸，前列腺組織EVs用70 μL PBS重懸)滴在經(jīng)輝光放電儀處理過的銅網(wǎng)上，吸附20 min，濾紙吸走多余液體。再用超純水滴漂洗1～3次。10 g/L乙酸雙氧鈾染色1 min，用濾紙吸去多余染液，自然晾干，在80 kV、JEM-1400透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 EVs的直徑分析

采用動態(tài)光散射粒徑分析法(dynamic light scattering,DLS)測定EVs的直徑。將純化得到的EVs用1 mL PBS重懸，分別添加到比色杯中，平衡2 min后測量。重復(fù)測量3次，使用儀器自帶軟件將DLS信號強度轉(zhuǎn)換為EVs直徑。

1.6 EVs蛋白質(zhì)組分分析

用適量PBS重懸EVs，裂解后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、考馬斯亮藍染色，取凝膠條帶進行脫色、還原、碘乙酰化和胰酶酶切，酶切后的蛋白多肽真空濃縮抽干。將肽段溶解后上樣到柱子中。移動相組成A(體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液)和B(體積分數(shù)0.1%甲酸乙腈溶液)，洗脫程序：體積分數(shù)(下同) 97%～92% A，3%～8% B，4 min；92%～80% A，8%～20% B，33.5 min；80%～75% A，20%～25% B，8.5 min；75%～70% A，25%～30% B，2 min；70%～20% A，30%～80% B，1 min；20% A，80% B，5 min；20%～97% A，80%～3% B，0.5 min；97% A，3% B，10.5 min；流速300 nL/min。質(zhì)譜全掃描范圍350～1 600 m/z。離子強度TOP25的母離子碎裂進行二級質(zhì)譜序列測定，生成質(zhì)譜檢測原始文件。質(zhì)譜檢測原始文件使用Proteome Discoverer軟件與NCBI小鼠蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進行搜庫計算分析，生成軟件計算結(jié)果文件。軟件計算結(jié)果保留結(jié)果可靠的多肽和蛋白，生成質(zhì)譜鑒定結(jié)果文件。質(zhì)譜鑒定結(jié)果中選擇≥2條不同的unique肽段的蛋白進行后續(xù)分析。用DAVID 6.8在線軟件對所得蛋白進行GO富集分析時，以count值為2、EASE 0.05為閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸、附睪和前列腺組織EVs的純化與鑒定

由圖1可知，采用TEI法分離純化的睪丸、附睪和前列腺組織EVs均可檢測到CD63和TSG101標(biāo)記蛋白，表明EVs分離成功。

圖1 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs標(biāo)記蛋白的免疫印跡分析Fig.1 Immunoblot analysis of EV markers in mouse testicular,epididymal and prostatic EVs

2.2 睪丸、附睪和前列腺組織EVs的電鏡觀察與直徑分布

透射電鏡觀察結(jié)果(圖2)顯示，小鼠睪丸、附睪和前列腺組織的EVs多呈凹杯狀，睪丸和附睪標(biāo)本中大小EVs均可見到，前列腺標(biāo)本中則以小EVs多見。

A.睪丸組織EVs；B.附睪組織EVs；C.前列腺組織EVs。箭頭標(biāo)示EVs，標(biāo)尺示100 nmA.Testicular EVs;B.Epididymal EVs;C.Prostatic EVs.Arrows indicate the EVs.Scale bar=100 nm

為了進一步明確睪丸、附睪和前列腺組織的EVs直徑分布，用DLS對睪丸、附睪和前列腺組織EVs樣品進行測量，結(jié)果(圖3)顯示，睪丸組織EVs的直徑分布于13～458 nm，其中以直徑30～140 nm的EVs數(shù)量居多；附睪組織EVs直徑分布于13～255 nm，其中以直徑30～165 nm的EVs數(shù)量居多，峰值在105 nm左右；前列腺組織EVs直徑分布于7～220 nm，其中以直徑40～120 nm的EVs數(shù)量居多，在50和90 nm左右各有一個峰值，在7～28 nm處還集中分布有一群小EVs。 EVs的DLS直徑分布結(jié)果與電鏡觀察到的結(jié)果基本一致，表明睪丸、附睪和前列腺組織EVs的大小分布有一定的差異。

圖3 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs的直徑分布Fig.3 Diameter distribution of mouse testicular,epididymal and prostatic EVs

2.3 睪丸、附睪和前列腺組織EVs的蛋白質(zhì)組分鑒定

睪丸、附睪和前列腺組織EVs蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果顯示，睪丸組織EVs中有1 148種蛋白，其中特有蛋白667種；附睪組織EVs中有902種蛋白，其中特有蛋白311種；前列腺組織EVs中有651種蛋白，其中特有蛋白142種。這些蛋白中睪丸與附睪組織EVs共有的蛋白有143種，附睪與前列腺組織EVs共有的蛋白有171種，睪丸與前列腺組織EVs共有的蛋白有61種，睪丸、附睪和前列腺組織EVs共有的蛋白有277種。將本研究質(zhì)譜結(jié)果與外泌體數(shù)據(jù)庫ExoCarta比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)睪丸組織EVs蛋白中有334種屬于已報道的小鼠外泌體蛋白，占蛋白總數(shù)的29%(334/1 148)；附睪組織EVs蛋白中有334種屬于已報道的小鼠外泌體蛋白，占蛋白總數(shù)的37%(334/902)；前列腺組織EVs蛋白中有285種屬于已報道的小鼠外泌體蛋白，占蛋白總數(shù)的44%(285/651)。用DAVID 6.8在線軟件對所得EVs 蛋白進行GO細胞組分富集分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，睪丸組織EVs蛋白有359種分布在外泌體中，占蛋白總數(shù)的31% (359/1 148)；附睪組織EVs蛋白有434種分布在外泌體中，占蛋白總數(shù)的48%(434/902)；前列腺組織EVs蛋白有336種分布在外泌體中，占蛋白總數(shù)的52% (336/651)。DAVID 6.8在線軟件分析結(jié)果與使用ExoCarta數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果基本一致。

A.睪丸組織EVs；B.附睪組織EVs；C.前列腺組織EVs A.Testicular EVs;B.Epididymal EVs;C.Prostatic EVs圖4 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs蛋白細胞組分的GO分析(count值排列前4項的結(jié)果)Fig.4 GO analysis of mouse testicular,epididymal and prostatic EVs proteins (top 4)

2.4 睪丸、附睪和前列腺組織EVs共有蛋白的分子功能、生物學(xué)過程和細胞組分分析

用DAVID 6.8在線分析軟件對睪丸、附睪和前列腺組織三者共有的277種蛋白進行GO分子功能、生物學(xué)過程和細胞組分富集分析,結(jié)果見表1～3。

表1 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs共有蛋白的分子功能分析Table 1 Molecular function of mouse testicular,epididymal and prostatic EVs common proteins

表2 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs共有蛋白的生物學(xué)過程分析Table 2 Biological process of mouse testicular,epididymal and prostatic EVs common proteins

表3 小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs共有蛋白的細胞組分分析Table 3 Cellular component of mouse testicular,epididymal and prostatic EVs common proteins

分子功能分析結(jié)果(表1)顯示，3種組織EVs共有蛋白主要發(fā)揮poly(A) RNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合、RNA結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能。生物學(xué)過程分析結(jié)果(表2)顯示，3種組織EVs共有蛋白主要參與翻譯、廣義的運輸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程。細胞組分分析結(jié)果(表3)顯示，有207種蛋白來自細胞質(zhì)，171種蛋白來自細胞膜，154種蛋白來自外泌體，124種來自細胞核，來自其他細胞組分的蛋白種類相對較少。

2.5 睪丸組織EVs特有蛋白的細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分析

使用DAVID 6.8在線分析軟件對睪丸組織EVs特有的667種蛋白進行GO細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程富集分析，結(jié)果見表4。

表4 小鼠睪丸組織EVs特有蛋白GO分析(count值排列前10項的結(jié)果)Table 4 GO analysis of mouse testicular EVs specific proteins (top 10)

表4顯示，睪丸組織EVs特有蛋白有391種來自細胞質(zhì)，359種來自細胞核，124種來自外泌體；主要發(fā)揮蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合、ATP結(jié)合、核酸結(jié)合等分子功能；主要參與mRNA加工(64種)、RNA剪接(50種)、精子發(fā)生(49種)、細胞周期(49種)和細胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)(37種)等生物學(xué)過程。

2.6 附睪組織EVs特有蛋白的細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分析

使用DAVID 6.8在線分析軟件對附睪組織EVs特有的311種蛋白進行GO細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程富集分析，結(jié)果(表5)顯示，附睪組織EVs所攜帶的特有蛋白中，157種來自細胞膜，153種來自細胞質(zhì)，118種來自在外泌體；主要發(fā)揮蛋白質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、ATP結(jié)合等分子功能；主要參與運輸(62種)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(34種)、代謝(26種)、脂質(zhì)代謝(23種)、氧化還原(22種)、蛋白水解(19種)和免疫過程(13種)等生物學(xué)過程。

表5 小鼠附睪組織EVs特有蛋白GO分析(count值排列前10項的結(jié)果)Table 5 GO analysis of mouse epididymal EVs specific proteins (top 10)

2.7 前列腺組織EVs特有蛋白的細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分析

使用DAVID 6.8在線分析軟件對前列腺組織EVs特有的142種蛋白進行GO細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程富集分析，結(jié)果(表6)顯示，前列腺組織EVs有71種分布在細胞質(zhì)，59種分布在外泌體，26種分布在線粒體等處；主要發(fā)揮核苷酸結(jié)合、水解酶活性、poly(A) RNA結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能；主要參與代謝過程(20種)、氧化還原過程(15種)、細胞間粘附(10種)等生物學(xué)過程。

表6 小鼠前列腺組織EVs特有蛋白GO分析(count值排列前10項的結(jié)果)Table 6 GO analysis of mouse prostatic EVs specific proteins (top 10)

表6(續(xù)) Continued Table 6

3 討 論

3.1 睪丸、附睪和前列腺組織EVs的形態(tài)和大小

本試驗電鏡和DLS結(jié)果均顯示，來自小鼠睪丸、附睪和前列腺組織的EVs大小分布有差異。睪丸組織中以30～140 nm的囊泡數(shù)量居多；附睪組織EVs直徑分布于13～255 nm，以直徑105 nm左右的EVs數(shù)量最多。目前有關(guān)睪丸組織EVs的研究報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，牛附睪小體存在異質(zhì)性，CD9+的附睪小體直徑為20～150 nm，與活的精子結(jié)合；CD9-附睪小體的直徑較大[15]。Ronquist[16]發(fā)現(xiàn)，人前列腺小體的大小分布在30～200 nm。本試驗發(fā)現(xiàn)，小鼠前列腺組織EVs直徑分布于7～220 nm，在50和90 nm左右各有一個峰值，在7～28 nm處還集中分布有一群小EVs。Aalberts等[17]根據(jù)囊泡大小將人的前列腺小體分為2個亞群：小的前列腺小體，直徑為(56±13) nm，含己糖神經(jīng)酰胺多；大的前列腺小體，直徑為(105±25) nm，含鞘磷脂多?？梢姴煌M織器官來源的EVs大小不同，同一組織來源的EVs大小也呈異質(zhì)性表現(xiàn)，而且不同大小的EVs所攜帶的內(nèi)容物可能存在差異，發(fā)揮的作用也可能不同。

3.2 睪丸、附睪和前列腺組織EVs的功能分析

精子在睪丸中發(fā)生，經(jīng)歷精原細胞的分裂增殖、精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的形態(tài)改變等階段。在本研究結(jié)果中，睪丸組織EVs特有蛋白富集最多的10個生物學(xué)過程中，有5個涉及到精子發(fā)生、細胞周期、細胞分裂和分化生物學(xué)過程。生殖細胞發(fā)育過程中RNA結(jié)合蛋白可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達。YBX蛋白(Y-box protein)是一類多功能RNA結(jié)合蛋白，可參與mRNA的轉(zhuǎn)錄、剪接和穩(wěn)定性的維持。有研究發(fā)現(xiàn)，YBX1突變會導(dǎo)致胚胎死亡；YBX2、YBX3突變可導(dǎo)致精母細胞和精子細胞凋亡數(shù)增加、精子細胞變形時細胞核濃縮失敗、精子分化缺陷及精子數(shù)量減少[18-19]。YBX1與RNA結(jié)合，協(xié)助某些RNA分子到外泌體中[20]。本研究在睪丸組織EVs質(zhì)譜分析中發(fā)現(xiàn)了YBX1、YBX2和YBX3，這提示睪丸組織EVs可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮一定作用。

精子形成后很少進行轉(zhuǎn)錄翻譯，其功能進一步成熟所需的蛋白質(zhì)主要依賴生殖管道的微環(huán)境供給[21]。附睪有較強的蛋白質(zhì)合成及分泌功能[22]，可以通過附睪小體攜帶一些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運給精子，對其腔內(nèi)精子的成熟及活性保持具有重要作用。本研究在附睪EVs中篩選到5型谷胱甘肽過氧化物酶(GPX5)，其是附睪EVs特有的一種蛋白，由附睪頭部分泌，被附睪小體轉(zhuǎn)移到精子表面，可能防止精子過早發(fā)生頂體反應(yīng)[23]。GPX5在保持精子DNA完整性、防止活性氧損傷精子中也發(fā)揮著一定作用[5]。乳脂球表皮生長因子(MFGE8)是一種細胞外囊泡標(biāo)記物，同時也存在于附睪小體中，用抗MFGE8的抗體孵育附睪小體后，可減少附睪小體與精子之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運[21]。MFGE8可介導(dǎo)精子與卵子的初始粘附[24-25]。這提示附睪組織EVs蛋白在精子活力保持及受精能力的獲得中發(fā)揮著一定的作用。

本試驗中前列腺組織EVs蛋白分子功能富集分析結(jié)果顯示，這些蛋白具有水解酶、氧化還原酶和肽酶等多種酶活性。有研究報道蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族可催化細胞中二硫鍵的形成、還原和重排，在調(diào)節(jié)硫醇-二硫鍵交換中較為重要，精子表面有蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族A3(PDIA3)的表達[26]。PDIA3可使免疫球蛋白超家族精卵融合蛋白1(Izumo1)、分化抗原9(CD9)或富含半胱氨酸分泌蛋白(CRISPs)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)精子膜與卵子膜融合[27]。本研究在前列腺組織EVs中也檢測到PDIA3，這提示前列腺小體可能轉(zhuǎn)運PDIA3到精子表面，從而調(diào)節(jié)精子的受精能力。

3.3 小樣本組織中EVs的分離純化

為明確各器官來源的EVs的成分，需要直接從器官組織中分離純化EVs。最近有從腦組織[28]和附睪組織[21]中純化EVs的報道。目前常用分離囊泡的方法有差速離心、免疫磁珠、超濾、TEI等，前三者盡管所得囊泡的純度較高，但樣品需求量大，得率低。TEI法簡單快速，可以從小樣本中獲取足量囊泡，但其獲得的囊泡純度不高[1,29]。本研究曾嘗試使用經(jīng)典的差速離心法分離純化EVs，但發(fā)現(xiàn)該法對于前列腺組織很難得到試驗所需的EVs量。因不同的分離方法得到的囊泡大小及種類不盡相同，為了便于比較3種組織來源的EVs蛋白，最終選擇了得率較高的TEI法進行試驗，結(jié)果證實通過此法較易從組織中獲得EVs，電鏡和DLS結(jié)果提示所得囊泡直徑變化范圍較大，這與文獻[30]的報道一致。所以對于某些繁殖力較低的突變小鼠，用TEI法可解決小樣本收集足量EVs的問題。在EVs分離過程中，很難避免因少量細胞破裂而釋放一些胞內(nèi)蛋白成分，這是直接從組織中分離囊泡面臨的一個共同問題，因此操作時手法應(yīng)盡量輕柔，并且后續(xù)對感興趣的蛋白應(yīng)進行驗證性試驗。

總之，本試驗獲得的數(shù)據(jù)不僅豐富了人們對小鼠睪丸、附睪和前列腺組織EVs蛋白質(zhì)的認識，更重要的是通過對各自特有蛋白質(zhì)的分析，為研究精子發(fā)育成熟的機制提供了參考。當(dāng)然，鑒于本試驗方法和技術(shù)手段的限制，所獲得的蛋白信息仍需進一步的試驗來驗證。