董萌萌，郝鵬澤，王佳柳，陳 歡，顏 華，賈良輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

全球家禽業(yè)每年約產(chǎn)生200萬(wàn)t的羽毛，大量羽毛堆積為病原微生物如弧菌和沙門(mén)氏菌提供了棲息地，同時(shí)排放出各種污染氣體，如NH3、N2O、H2S等，對(duì)人類的生活生產(chǎn)產(chǎn)生不良影響[1]。羽毛的主要成分是角蛋白，富含絲氨酸、纈氨酸、賴氨酸、色氨酸和胱氨酸，由α-螺旋和β-折疊構(gòu)象組成。羽毛的外部主軸幾乎完全由β-折疊組成，β-折疊構(gòu)象中胱氨酸含量高，相比α-螺旋結(jié)構(gòu)有更多的二硫鍵和更少的孔隙結(jié)構(gòu)，因此被稱為硬性角蛋白，不能被常見(jiàn)的胰蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白水解酶降解[2]。但是羽毛又是肽、必需氨基酸和一些氮、磷、鉀等礦物質(zhì)的良好來(lái)源[3-4]，如何將羽毛資源變廢為寶一直是科研工作者致力解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)的羽毛處理方法主要是焚化和化學(xué)法降解，如堿水解或加壓蒸煮，不僅消耗了大量能量，降低了蛋白質(zhì)的整體質(zhì)量，破壞了賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸等必需氨基酸，而且形成了賴氨肽胺丙氨酸和羊毛硫氨酸等非營(yíng)養(yǎng)性氨基酸[5-7]。目前，用角蛋白分解菌對(duì)羽毛進(jìn)行生物降解是一種有效、經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的羽毛處理方法，可以將羽毛廢料生物轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)平衡、可消化的羽毛裂解液，其中含有多種游離氨基酸、肽和銨離子[8-9]。細(xì)菌、放線菌和真菌中均已發(fā)現(xiàn)能夠分解羽毛的菌株[10]，常見(jiàn)的如放線菌中的鏈霉菌屬(Streptomyces)以及細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)和短小芽孢桿菌屬(Bacilluspumilis)等[2]，主要產(chǎn)生絲氨酸類蛋白酶或金屬蛋白酶類，可應(yīng)用于高蛋白動(dòng)物飼料[9]和植物含氮肥料添加劑[11]的開(kāi)發(fā)及原料皮的脫毛、洗滌劑的生產(chǎn)等領(lǐng)域[12-13]。因此，羽毛降解菌的發(fā)掘?yàn)殚_(kāi)發(fā)成本低廉且生態(tài)友好的羽毛處理方式提供了新的思路。

本研究從土壤樣品中篩選分離到1株高效降解羽毛的菌株，初步鑒定為蠟樣芽胞桿菌BacilluscereusDHW-06；同時(shí)探究菌株DHW-06的最佳產(chǎn)酶條件，并以此條件進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，為角蛋白酶的分離純化提供理論依據(jù)，并為研究羽毛的降解機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 土壤樣品采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)寄生蟲(chóng)中心。雞羽毛收集于家禽市場(chǎng)，自來(lái)水洗凈，純水洗3次，60 ℃烘干至恒質(zhì)量。

1.1.2 主要試劑 克隆菌株大腸桿菌DH5α，為本實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19-T載體連接試劑盒，購(gòu)自大連寶生物公司。2×AccurateTaq預(yù)混液和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自湖南艾科瑞生物公司；酪蛋白，購(gòu)自上海源葉生物公司；天青角蛋白，購(gòu)自Sigma生物公司；福林酚、二甲基亞砜(DMSO)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和β-巰基乙醇，購(gòu)自北京索萊寶生化試劑公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 羽毛粉培養(yǎng)基：羽毛粉10 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO40.4 g/L，MgCl2·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.06 g/L，瓊脂20 g/L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.4 g/L，pH 7.5；牛奶培養(yǎng)基：10%脫脂奶粉與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按照1∶9的比例均勻混合；LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；液體羽毛培養(yǎng)基：羽毛(整根)10 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO40.4 g/L，MgCl2·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.06 g/L。

1.2 羽毛降解菌的分離篩選

1.2.1 羽毛降解菌的初篩 稱取土壤樣品1 g，研磨成粉末狀置于三角瓶中，加入9 mL無(wú)菌生理鹽水，90 ℃水浴加熱2 h后，28 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，使其充分混勻。得到的土壤懸液接種至羽毛粉培養(yǎng)基上。挑選平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落轉(zhuǎn)接至牛奶培養(yǎng)基中，挑取平板上能夠產(chǎn)生明顯水解圈的菌落進(jìn)行傳代，淘汰酶活力不穩(wěn)定或生長(zhǎng)能力較弱的菌株。

1.2.2 羽毛降解菌的復(fù)篩 將水解圈明顯且長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定的菌種活化后接種至含整根羽毛的液體羽毛培養(yǎng)基中。于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔12 h觀察羽毛降解情況。

1.2.3 分離菌株羽毛降解率的測(cè)定 準(zhǔn)確稱量并記錄液體羽毛培養(yǎng)基中整根羽毛的質(zhì)量(保留至小數(shù)點(diǎn)后4位)，接種已培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)的分離菌株，37 ℃恒溫、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基中羽毛的降解情況,并對(duì)羽毛降解液進(jìn)行真空抽濾，將吸附有羽毛殘?jiān)臑V紙?jiān)诤嫦渲懈稍镏梁阗|(zhì)量，采用失重法測(cè)定降解率：羽毛降解率=(羽毛干質(zhì)量-殘?jiān)少|(zhì)量)/羽毛干質(zhì)量×100%。試驗(yàn)篩選出的菌株用甘油保藏。

1.3 羽毛降解菌株的鑒定

1.3.1 菌株的形態(tài)特征檢測(cè) 挑取少量甘油保藏菌株，劃線接種于LB平板上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌株的形態(tài)特征，并挑取少量菌體進(jìn)行顯微鏡觀察和革蘭氏染色觀察。

1.3.2 菌株的生理生化特征檢測(cè) 生理生化試驗(yàn)根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行，其中NaCl梯度設(shè) 0,10，20，…，100 g/L，pH梯度設(shè)5，6，7，…，12。

1.3.3 菌株的16S rRNA鑒定 根據(jù)16S rRNA序列的保守性，設(shè)計(jì)通用引物，PF:5′-AGAGTTTGATTCTGGCTC-3′，PR:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物由擎科生物公司合成。采用Kirby Mix法提取菌株DHW-06的基因組DNA。PCR擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA，反應(yīng)體系為：2×AccurateTaq預(yù)混液 25 μL，引物PF和PR各1 μL，基因組DNA 1 μL，二甲基亞砜(DMSO)5 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足50 μL體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32次循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆送至擎科生物公司測(cè)序。使用NCBI的Blast軟件對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行同源性分析，選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與該序列相似度較高的14條16S rRNA序列，用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)后，再用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 羽毛降解菌株的產(chǎn)酶條件

1.4.1 角蛋白酶活力的測(cè)定 采用酪蛋白作為底物進(jìn)行酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和角蛋白酶活力的測(cè)定。在試管中加入1 mL 20 g/L的酪蛋白溶液(pH 8.0)，預(yù)熱2 min后加入1 mL過(guò)濾后的粗酶液，精確反應(yīng)10 min，立刻加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，混勻后置于40 ℃保溫20 min，12 000 r/min離心10 min后取1 mL上清樣品，加入1 mL福林酚試劑和5 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉溶液，混勻后40 ℃保溫發(fā)色20 min，于660 nm處測(cè)定吸光度(OD660)。繪制吸光度(OD660)與酪氨酸質(zhì)量濃度(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將試驗(yàn)獲得的吸光度(OD660)換算成酪氨酸質(zhì)量濃度(μg/mL)。1 mL粗酶液精確反應(yīng)10 min后，每釋放出1.0 μg酪氨酸，定義為1個(gè)酶活單位(U)[15]。

1.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 將菌株的發(fā)酵種子液培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，以適當(dāng)?shù)谋壤D(zhuǎn)接入液體羽毛培養(yǎng)基，在37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，期間每隔3 h取發(fā)酵液上清樣品，測(cè)定角蛋白酶活力。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。

1.4.3 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 將OD600為0.6的菌液轉(zhuǎn)接入液體羽毛培養(yǎng)基，接種量分別為體積分?jǐn)?shù)1.5%，3.0%和6.0%，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，于培養(yǎng)的10，12和14 h，分別取發(fā)酵液上清樣品，測(cè)定角蛋白酶活力。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。

1.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 將OD600為0.6的菌液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量轉(zhuǎn)接入液體羽毛培養(yǎng)基，分別在22，27，32，37和42 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，取發(fā)酵液上清樣品，測(cè)定角蛋白酶活力。每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。

1.4.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 將OD600為0.6的菌液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量轉(zhuǎn)接入液體羽毛培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的初始pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)10 h，取發(fā)酵液上清樣品，測(cè)定角蛋白酶活力。每個(gè)pH梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。

1.5 羽毛降解菌株的酶學(xué)特性

1.5.1 粗酶液的最適反應(yīng)溫度及其溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 (1)以酪蛋白為底物測(cè)定粗酶液的最適反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度分別設(shè)定為30，40，50，60，70和80 ℃，試驗(yàn)方法同1.4.2節(jié)，測(cè)定不同反應(yīng)溫度下的酶活力。每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。以試驗(yàn)組最大酶活力為100%，確定其他試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

(2)以酪蛋白為底物測(cè)定粗酶液的溫度穩(wěn)定性。將樣品分別在30，40，50，60和70 ℃的條件下保溫30 min后，測(cè)定不同溫度處理后的酶活力。每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置不加底物的處理為對(duì)照。以試驗(yàn)組最大酶活力為100%，確定其他試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

1.5.2 粗酶液最適pH的測(cè)定 以酪蛋白作為底物測(cè)定粗酶液的最適反應(yīng)pH。分別配制pH 6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的PBS緩沖液(用0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH為6.0，7.0；用0.2 mol/L NaOH-硼酸緩沖液調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH為8.0～10.0)，將底物溶于其中進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)pH梯度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)不加底物的處理為對(duì)照。以試驗(yàn)組最大酶活力為100%，確定其他試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

1.5.3 金屬離子對(duì)粗酶液的影響 以酪蛋白為底物測(cè)定不同金屬離子對(duì)粗酶液的影響。在2 mL的反應(yīng)體系中分別加入低濃度(1 mmol/L)和高濃度(10 mmol/L)的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+和Mn2+，按照1.4.2節(jié)的方法測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶活力的影響。每種金屬離子在2種濃度下均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)不加金屬離子的處理為對(duì)照。以對(duì)照處理的酶活力為100%，確定試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

1.5.4 化學(xué)試劑對(duì)粗酶液的影響 以酪蛋白為底物測(cè)定化學(xué)試劑DMSO、β-巰基乙醇、異丙醇、EDTA、PMSF、SDS和DTT對(duì)酶活力的影響，反應(yīng)體系為2 mL，化學(xué)試劑設(shè)定低和高2種水平處理，低濃度處理中DMSO、β-巰基乙醇和異丙醇均為體積分?jǐn)?shù)1%，EDTA、PMSF、SDS和DTT均為1 mmol/L；高濃度處理中DMSO、β-巰基乙醇和異丙醇均為體積分?jǐn)?shù)10%，EDTA、PMSF、SDS和DTT均為10 mmol/L。每種化學(xué)試劑在2種水平均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)不加化學(xué)試劑的處理為對(duì)照。以對(duì)照處理的酶活力為100%，確定試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

1.5.5 粗酶液的底物特異性試驗(yàn) 以可溶性底物牛血清蛋白、角蛋白、牛血紅蛋白和酪蛋白及不可溶底物天青角蛋白和羽毛粉，測(cè)定菌株粗酶液對(duì)不同底物的利用能力?？扇苄缘孜锏姆磻?yīng)體系為2 mL，包括1 mL 20 g/L的底物溶液(pH 8.0)和1 mL的粗酶液；不可溶底物的反應(yīng)總體系為4 mL，包括40 mg不可溶底物，2 mL的粗酶液和2 mL PBS緩沖液(pH 8.0)，混勻后在37 ℃下180 r/min反應(yīng)2 h，離心取上清樣品，然后按照1.4.2節(jié)的相應(yīng)方法測(cè)定酶活力。每種底物均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)不加底物的處理為對(duì)照。以酪蛋白為底物的酶活力為100%，確定其他底物的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽毛降解菌株的分離篩選

試驗(yàn)篩選出1株羽毛降解菌，命名為DHW-06，在羽毛培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，其羽毛降解情況如圖1所示，羽毛降解率達(dá)71.38%。

圖1 分離菌株DHW-06的羽毛降解效果Fig.1 Degradation of feather by bacterial isolation DHW-06

2.2 羽毛降解菌株DHW-06的鑒定

2.2.1 形態(tài)和生理生化特征 菌株DHW-06在37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h時(shí)菌落大，白色圓形，表面濕潤(rùn)有光澤。菌株DHW-06革蘭氏染色呈紫紅色，是1株桿狀、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(圖2)。生理生化特征鑒定結(jié)果(表1)顯示，菌株DHW-06能利用葡萄糖、蔗糖等碳源；在不含NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，能在含有70 g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；能夠分解明膠，但不能利用尿素、檸檬酸鈉和苯丙氨酸； pH耐受能力強(qiáng)，在pH 5～10條件下均生長(zhǎng)良好。

圖2 羽毛降解菌株DHW-06的形態(tài)觀察(×100)Fig.2 Morphology of strain DHW-06 under microscope (×100)

表1 羽毛降解菌株DHW-06的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characters of strain DHW-06

2.2.2 16S rRNA序列分析 由圖3可知，菌株DHW-06的16S rRNA序列與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)相似度最高，達(dá)98%，因此初步鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

圖3 羽毛降解菌株DHW-06的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Construction of phylogenetic tree of feather degrading strain DHW-06 based on 16S rRNA sequence

2.3 羽毛降解菌株DHW-06的產(chǎn)酶條件研究

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株DHW-06產(chǎn)酶的影響 由圖4-A可知，在培養(yǎng)12 h時(shí)，角蛋白酶活力達(dá)到最高值，為64.30 U/mL。

2.3.2 接種量對(duì)菌株DHW-06產(chǎn)酶的影響 由圖4-B可知，當(dāng)接種量為體積分?jǐn)?shù)1.5%時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)角蛋白酶活力逐漸升高，培養(yǎng)14 h時(shí)，角蛋白酶活力達(dá)104.51 U/mL；當(dāng)接種量為體積分?jǐn)?shù)3.0%時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)角蛋白酶活力逐漸降低，培養(yǎng)10 h時(shí)，角蛋白酶活力達(dá)到最高值，為107.62 U/mL；當(dāng)接種量為體積分?jǐn)?shù)6.0%時(shí)，角蛋白酶活力在12 h時(shí)達(dá)到峰值，為55.85 U/mL。將接種量體積分?jǐn)?shù)3.0%，發(fā)酵時(shí)間10 h作為后續(xù)研究的發(fā)酵條件。

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株DHW-06產(chǎn)酶的影響 由圖4-C可以看出，37 ℃時(shí)角蛋白酶活力最高，達(dá)122.27 U/mL。

2.3.4 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株DHW-06產(chǎn)酶的影響 由圖4-D可知，在初始pH為6.5～7.5時(shí)，角蛋白酶活力均處于相對(duì)較高的水平，其中pH為6.5時(shí)角蛋白酶活力最高，為129.47 U/mL。

2.4 羽毛降解菌株DHW-06粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)溫度和穩(wěn)定性 由圖5-A可以看出，菌株DHW-06粗酶液的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。由圖5-B可知，菌株DHW-06粗酶液在30～50 ℃條件下處理30 min后仍能保留85%以上的相對(duì)酶活力，表明該酶的耐熱性較好；在60 ℃以上穩(wěn)定性較差，高于70 ℃酶活力幾乎完全喪失。

2.4.2 最適反應(yīng)pH 粗酶液的最適pH測(cè)定結(jié)果(圖6)表明，該酶能夠耐受的pH范圍較廣，在pH 6.0～10.0均有活性，在pH 8.0時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最高值，表明該酶在微堿性環(huán)境中能發(fā)揮最大活力。

2.4.3 金屬離子對(duì)粗酶液活力的影響 由表2可知，Mn2+和Cu2+對(duì)粗酶液具有顯著的激活作用，低濃度的Mn2+和Cu2+分別使相對(duì)酶活力提高94%和21%，高濃度的Mn2+和Cu2+分別使相對(duì)酶活力提高300%和120%；K+、Mg2+、Ca2+和Ni2+均對(duì)粗酶液有微弱的激活作用；Fe3+和Zn2+在低濃度下對(duì)粗酶液有不同程度的抑制作用，而在高濃度下又有促進(jìn)作用。結(jié)果說(shuō)明，該酶活力的發(fā)揮需要金屬離子的參與，以維持酶活性中心的穩(wěn)定。

2.4.4 化學(xué)試劑對(duì)粗酶液活力的影響 由表3可以看出，低濃度和高濃度的β-巰基乙醇分別使相對(duì)酶活力提高1 525.03%和1 658.95%；低濃度和高濃度的DTT分別使相對(duì)酶活力提高36.26%和577.99%；低濃度的PMSF可使相對(duì)酶活力喪失35.32%；低濃度的EDTA使相對(duì)酶活力提高30.3%，高濃度的EDTA使相對(duì)酶活力喪失59.08%；SDS、DMSO和異丙醇對(duì)粗酶液均有不同程度的抑制作用。

表3 化學(xué)試劑對(duì)羽毛降解菌株DHW-06粗酶液活力的影響Table 3 Effect of chemicals on activity of crude enzyme from strain DHW-06

2.4.5 粗酶液的底物特異性 粗酶液的底物特異性結(jié)果(表4)顯示，該酶具有廣泛的底物適應(yīng)能力，能夠降解可溶性底物酪蛋白、角蛋白、牛血清蛋白和牛血紅蛋白，也可以降解不可溶底物天青角蛋白和羽毛粉。該酶對(duì)角蛋白的降解能力最強(qiáng)。

表4 底物對(duì)羽毛降解菌株DHW-06粗酶液活力的影響Table 4 Effects of substrates on enzymatic activity of crude enzyme from strain DHW-06

3 討論與結(jié)論

本研究成功地從土壤中分離到1株新型羽毛降解菌DHW-06，根據(jù)其形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA序列分析，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌；菌株DHW-06產(chǎn)芽孢、桿狀，抗逆性強(qiáng)，耐高溫、耐鹽，在pH 6.0～10.0環(huán)境中均能良好生長(zhǎng)，能在48 h將培養(yǎng)基中的羽毛降解，其降解效率高于其他大多芽孢桿菌屬的細(xì)菌[16-17]。菌株DHW-06的最適生長(zhǎng)溫度也是其最佳的發(fā)酵溫度。微生物的生長(zhǎng)階段分為4個(gè)時(shí)期，即遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。角蛋白酶活力通常在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期前期開(kāi)始緩慢積累，在對(duì)數(shù)期后期或穩(wěn)定期達(dá)到最大值，而蠟樣芽孢桿菌的最大酶活力出現(xiàn)在穩(wěn)定期[18]。不同的接種量使菌株DHW-06生長(zhǎng)到穩(wěn)定期階段的時(shí)間有所不同，故接種量為體積分?jǐn)?shù)1.5%，角蛋白酶活力峰值出現(xiàn)在發(fā)酵14 h時(shí)；接種量為體積分?jǐn)?shù)3.0%，角蛋白酶活力峰值出現(xiàn)在發(fā)酵10 h時(shí)。菌株DHW-06發(fā)酵24 h后角蛋白酶活力驟降，但仍能高效降解羽毛，推測(cè)其可同時(shí)產(chǎn)胞外角蛋白酶和胞內(nèi)角蛋白酶[19]。

相關(guān)文獻(xiàn)表明，地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisHK-1和BacilluslicheniformisPWD-1)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisKD-N2)產(chǎn)生的角蛋白酶的最適反應(yīng)條件為50～55 ℃和pH 7.0～9.0[20-22]。本試驗(yàn)菌株DHW-06粗酶液的最適反應(yīng)條件為60 ℃，pH 8.0。除低濃度(1 mmol/L)的Fe3+和Zn2+外，其他金屬離子激活劑均能夠提高菌株DHW-06的酶活力，推測(cè)金屬離子在穩(wěn)定酶活性位點(diǎn)、維持酶構(gòu)象穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。角蛋白降解的第一步是二硫鍵還原酶催化二硫鍵斷裂[23-26]，β-巰基乙醇和二硫基蘇糖醇(DTT)是常見(jiàn)的還原劑，能夠催化二硫鍵斷裂，使酶活力大大提高。PMSF是常見(jiàn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明PMSF可抑制菌株DHW-06的酶活力，表明該菌株所產(chǎn)生的酶可能屬于絲氨酸蛋白酶類。菌株DHW-06的粗酶液對(duì)可溶性底物酪蛋白和角蛋白等及不可溶底物天青角蛋白和羽毛粉均有降解能力。菌株DHW-06能夠在羽毛底物中快速生長(zhǎng)，表明其在技術(shù)工藝上具備可行性，具有廣闊的應(yīng)用前景。