袁 逸，戴程婷，李一卉，王 莉，袁慶新*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029；2解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210002；3中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210002

糖尿病是嚴重危害人類健康的疾病，其病因可以追溯到胚胎發(fā)育，宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）是指胎兒出生體重低于胎齡平均體重的第10百分位數(shù)，是一種常見的產(chǎn)科并發(fā)癥，IUGR 與糖尿病、肥胖、高血壓等代謝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，IUGR 新生鼠胰重、體重、胰重/體重小于正常鼠，胰腺組織免疫熒光顯示IUGR 新生鼠胰島面積明顯減少，胰島素染色減弱，胰島較正常少且松散，成年后IUGR鼠表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗，甚至發(fā)生糖尿?。?-6］。為明確IUGR鼠發(fā)生胰島素抵抗及2型糖尿病的病因，我們對IUGR新生鼠進行測序及轉(zhuǎn)錄組分析。

表觀遺傳是指在基因序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達發(fā)生改變［7］，并且可以持續(xù)影響后代［8］。表觀遺傳可分為DNA 甲基化、非編碼RNA 的影響、組蛋白的翻譯后修飾、遺傳印記等，其中長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）近年來備受關(guān)注。LncRNA 是指轉(zhuǎn)錄本大于200 bp 的RNA，具有典型的mRNA 結(jié)構(gòu)，位于細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，不具有編碼蛋白的能力。Morán 等［9］在人胰島細胞轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)并且鑒定出了128條LncRNA，部分被證實參與胚胎胰腺發(fā)育。后來在小鼠胰腺中也發(fā)現(xiàn)調(diào)控胰島發(fā)育的LncRNA［10］。但目前相關(guān)研究不多，且具體機制仍不明確。

本研究通過孕期給予8%的低蛋白飼料構(gòu)建IUGR小鼠模型，對IUGR及正常新生鼠胰腺組織進行高通量測序轉(zhuǎn)錄組分析，探尋IUGR 新生鼠胰腺基因組表達差異，揭示相關(guān)LncRNA在IUGR糖尿病發(fā)病中的作用及影響，為糖尿病發(fā)病機制研究提供新思路及治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 周齡C57BL/6 小鼠購于南京醫(yī)科大學動物中心，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學峨眉嶺動物房，小鼠適應環(huán)境1周后，傍晚以雌鼠∶雄鼠=2∶1進行合籠，次日清晨以陰道有精栓且涂片發(fā)現(xiàn)精子為確定妊娠。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會批準。

對照組：孕鼠自受孕開始飼以標準繁殖飼料（蛋白含量為20%）；IUGR組：孕鼠自受孕開始飼以低蛋白飼料（蛋白質(zhì)含量為8%且等熱量）至小鼠出生。

IUGR 造模成功標準：新生小鼠出生體重低于孕周正常對照組體重的第十百分位或平均體重的2 個標準差。

1.1.2 胰腺組織

將新生正常小鼠、IUGR 小鼠取出，分別稱重，將符合IUGR小鼠體重的小鼠取出，將小鼠麻醉、固定、剖開腹腔、取出胰腺組織，放于液氮中。新生正常小鼠、IUGR小鼠各3只。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

按照TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）說明書提取RNA，經(jīng)DEPC 水溶解后，按照Nano Drop 分光光度儀測定RNA 濃度和純度。采用Primer-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TakaRa 公司，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄反應。

1.2.2 測序、質(zhì)量評估

小鼠胰腺RNA提取及質(zhì)檢、基因檢測及數(shù)據(jù)分析由廣州基迪奧生物科技有限公司進行。用Illumina HiSeq TM 4000 進行測序，并對數(shù)據(jù)樣本進行過濾、質(zhì)量評估，合格后進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 生物信息學分析

通過Tophat 對篩選出來的高質(zhì)量樣本比對核糖體RNA 的reads，去除核糖體RNA 對結(jié)果的干預。使用Cufflinks根據(jù)Tophat的比對結(jié)果來重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)組裝出來的轉(zhuǎn)錄本在參考基因組上的位置以及轉(zhuǎn)錄本長度≥200 bp 且exon 數(shù)目≥2，篩選出新的轉(zhuǎn)錄本并進行新LncRNA預測。對轉(zhuǎn)錄本進行定量分析，并根據(jù)FDR＜0.05，且|log2Fc|＞1 計算兩組樣本LncRNA、mRNA 的表達差異。使用RNA plex、LncRNA 與mRNA 的表達量相關(guān)性Pearson 相關(guān)系數(shù)分析等方法預測LncRNA 靶基因及其功能，對LncRNA 靶基因、mRNA 進行基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEEG）信號通路聚類分析。GO 富集結(jié)果包括：生物學途徑（biological process，BP）、細胞組件（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。

1.2.4 qRT-PCR反應

采用SYBR Premix Ex TaqTM（TakaRa公司，日本）將cDNA進行實時熒光定量PCR進行差異LncRNA的驗證。反應體系為模板cDNA 2 μL，TB GreenPremix Ex Taq 10 μL，熒光定量PCR 參比染料（ROX）0.4 μL，正義引物（F Primer）0.4 μL，反義引物（R primer）0.4 μL，滅菌ddH2O 6.8 μL。反應條件：預變性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s40個循環(huán)。根據(jù)熔解曲線判斷引物的特異性及擴增效率，采用2-ΔΔct法對基因相對表達量進行分析。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.5 MIN6細胞培養(yǎng)

MIN6 細胞培養(yǎng)基的主要成分為高糖DMEM 培養(yǎng)基、15%胎牛血清（FBS），雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）、2.5 mmol/L β-巰基乙醇。細胞置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)基，細胞融合度達80%傳代。

1.2.6 不同糖濃度刺激

選擇無糖培養(yǎng)基，利用葡萄糖粉配置11.1、16.7、25.0、33.3 mmol/L 不同糖濃度的培養(yǎng)基；將MIN6 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，加入無糖低血清（0.25%）培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h后，分別加入不同糖濃度培養(yǎng)基2 mL，做好標記，放入培養(yǎng)箱，24 h收取細胞并提取RNA。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS21.0軟件分析實驗結(jié)果，基因表達量均以均值±標準差（）表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA的相關(guān)分析

2.1.1 LncRNA總數(shù)與差異情況

在正常、IUGR 新生鼠中共鑒定出30 426 個LncRNA。兩組中表達差異的LncRNA 有294 個，其中上調(diào)83 個，下調(diào)211 個。差異表達LncRNA 的火山圖和熱圖見圖1。表2 顯示了部分高差異表達的LncRNA。

表2 部分差異上調(diào)或下調(diào)的LncRNAsTable 2 Part differentially up-or down-regulated LncRNAs

圖1 IUGR、正常新生小鼠差異表達LncRNAFigure1 Differentially expressed LncRNAs between IUGR and normal neonatal mice

2.1.2 差異LncRNA 靶基因KEEG 信號通路與GO功能富集分析

LncRNA 與mRNA 的調(diào)控包括Antisense、Cis、Trans 調(diào)控。Antisense 是指一部分反義LncRNA 與正義鏈的mRNA 結(jié)合而調(diào)控基因沉默、轉(zhuǎn)錄及mRNA 穩(wěn)定性。Cis 是指同一染色體上臨近mRNA的轉(zhuǎn)錄激活與表達調(diào)控，一般選取LncRNA 上下游10 kb范圍內(nèi)的基因作為此LncRNA的Cis調(diào)控靶基因。Trans 是指LncRNA 的功能與其共表達的蛋白編碼基因相關(guān)，通過樣本間LncRNA 與蛋白編碼基因的表達量相關(guān)分析或共表達分析方法來預測其靶基因。

Antisense：差 異LncRNA Antisense 靶基因KEEG、GO富集分析如圖2所示，按照KEEG 信號通路富集分析中基因數(shù)量，前5 位分別是“metabolic pathway”（512 個基因）、“pathway in cancer”（206 個基因）、“MAPK signaling pathway”（167 個基因）、“PI3K-Akt signaling pathway”（158個基因）、“Ras signaling pathway”（140個基因）（圖2A）。按照GO分析基因表達數(shù)目可知，BP 中前5 位的是“cellular process”“single-organism process”“biological regulation”“metabolicprocess”“response to stimulus”，CC 前5 位是“cell”“cell part”“organelle”“membrane”“member part”，MF 前5 位 是“binding”“catalytic activity”“transporter activity”“molecular function regulator”“nucleic and binding transcription factor activity”（圖2B）。

圖2 差異LncRNA Antisense作用靶基因KEEG和GO富集分析Figure 2 The KEEG and GO enrichment analysis of differentially expressed LncRNA antisense target genes

Cis：差異LncRNA Cis 調(diào)控靶基因GO、KEEG富集分析如圖3所示。按照KEEG信號通路富集分析中基因數(shù)量，前5 位分別是“metabolic pathway”（839個基因）、“pathway in cancer”（285 個基因）、“Endocytosis”（228 個基因）、“HTLV-1 infection”（181 個基因）、“Proteoglycans in cancer”（171 個基因）（圖3A）。按照GO分析基因表達數(shù)目可知，BP中前5位是“cellular process”“single-organism process”“biological regulation”“metabolicprocess”“response to stimulus”，CC 前5 位是“cell”“cellpart”“organelle”“membrane”“organelle part”，MF 前5 位是“binding”“catalytic activity”“transporter activity”“molecular function regulator”“nucleic and binding transcription factor activity”（圖3B）。

圖3 差異LncRNA Cis作用靶基因KEEG、GO富集分析Figure 3 The KEEG and GO enrichment analysis of differentially expressed LncRNA Cis target genes

Trans：差 異LncRNA Trans 調(diào)控靶基因GO、KEEG 富集分析如圖4 所示。按照KEEG 信號通路富集分析中基因數(shù)量，前5 位分別是“pathway in cancer”（260 個基因）、“Neuroactive ligand-receptor interaction”（173個基因）、“HTLV-1 infection”（166個基因）、“cAMP signaling pathway”（157個基因）、“Adrenergic signaling in cardiomyocytes”（138 個基因）（圖4A）。按照GO分析基因表達數(shù)目可知：BP中前5位是“cellular process”“single-organism process”“biological regulation”“metabolic process”“response to stimulus”，CC 前5 位 是“cell”“cell part”“organelle”“membrane”“membrane part”，MF 前5 位是“binding”“catalytic activity”“transporter activity”“molecular transducer activity”“signal transducer activity”（圖4B）。

圖4 差異LncRNA Trans作用靶基因KEEG和GO富集分析Figure 4 The KEEG and GO enrichment analysis of differentially expressed LncRNA Trans target genes

2.2 mRNA相關(guān)分析

2.2.1 mRNA表達差異情況

在正常、IUGR 新生鼠中共檢測出66 652 個mRNA，2 000個差異表達mRNA，其中1 711個上調(diào)，289個下調(diào)，部分差異表達mRNA如表3所示。

2.2.2 差異mRNA GO 功能與KEEG 信號通路富集分析

mRNA 差異表達KEEG 和GO 信號通路富集分析見圖5。按照KEEG 信號通路富集分析中基因數(shù)量比，前5 位分別是“PI3K-Akt signaling pathway”（111 個基因）、“Endocytosis”（104 個基因）“MAPK signaling pathway”（100 個基因）、“Rap1 signaling pathway”（86 個基因）、“FoxO signaling pathway”（64個基因）（圖5A）。按照GO分析基因表達數(shù)目可知：BP 中 前5 位 是“cellular process”“biological regulation”“metabolic process”“response to simullus”“developmental process”，CC 前5 位是“cell”“cell part”“organelle”“organelle part”“membrane”，MF前五5位是“binding”“catalytic activity”“molecular function regulator”“nucleic and binding transcription factor activity”“molecular function regulator”（圖5B）。

圖5 IUGR、正常新生小鼠差異表達mRNAs KEEG和GO富集分析圖Figure 5 The KEEG and GO enrichment analysis of differentially expressed mRNAs

2.3 LncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡

對差異Lnc RNA 和差異mRNA 關(guān)系均進行了Antisense、Cis、Trans作用分析，具體關(guān)系如圖6～8所示，圖中紅色表示差異表達LncRNA，綠色表示差異表達mRNA。在3種作用關(guān)系中，差異LncRNA與差異mRNA在Trans作用上相關(guān)性強，作用豐富。

圖6 差異LncRNA與差異mRNA的Antisense作用圖Figure 6 The Antisense between differentially expressed LncRNA and mRNA

圖7 差異LncRNA與差異mRNA的Cis作用圖Figure 7 The Cis between differentially expressed LncRNAs and mRNAs

圖8 差異表達LncRNA與差異表達mRNA的Trans作用圖Figure 8 The Trans between differentially expressed LncRNAs and mRNAs

2.4 差異表達基因驗證

通過對差異表達LncRNA 及其作用分析，高差異表達LncRNA 如表4 所示，從中挑選了差異表達且與生長發(fā)育相關(guān)的LncRNA Snhg12、LncRNA Rian在IUGR、正常新生小鼠中進行驗證，表達結(jié)果如圖9所示，與測序結(jié)果一致。

圖9 LncRNA Snhg12（A）、LncRNA Rian（B）在IUGR、正常新生小鼠中的表達Figure 9 The expression of LncRNA Snhg12（A）and LncRNA Rian（B）between IUGR and normal neonatal mice

表4 高差異表達LncRNATable 4 LncRNAs with high differential expression

為驗證基因與糖尿病相關(guān)性，我們測定了MIN6細胞在不同糖濃度下基因表達情況（圖10）。LncRNA Snhg12 在低糖濃度（5.0、11.1、16.7 mmol/L）、高糖濃度（33.3 mmol/L）下表達量較正常糖濃度增加；LncRNA Rian 在低糖濃度（5、11.1、16.7 mmol/L）、高糖濃度（33.3 mmol/L）下表達量較正常糖濃度下降，即Lnc RNA Snhg12、Rian表達受糖濃度調(diào)控。

3 討論

IUGR作為產(chǎn)科并發(fā)癥，產(chǎn)后及成年后可引起糖尿病、心血管疾病等一系列代謝病，在鼠［5，11］、人［12］及其他靈長類動物［13-14］中均有驗證，但IUGR引起糖耐量異常的具體機制目前仍不明確。本研究通過高通量測序?qū)UGR 的轉(zhuǎn)錄組進行分析，旨在探究LncRNA 在IUGR 胰島發(fā)育及成年發(fā)生2 型糖尿病中的作用。

隨著RNA 組學的發(fā)展，LncRNA 被認為是參與胰島發(fā)育、糖尿病及其并發(fā)癥以及IUGR 發(fā)病過程中的新型調(diào)節(jié)因子。H19 下調(diào)導致IUGR 胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲減少［12］。LncRNA NEAT1通過激活Akt/mTOR 信號通路促進小鼠腎系膜細胞的增殖和纖維化，加速糖尿病腎病進程［15］。LncRNA MALAT1 通過抑制microRNA let-7f、激活KLF5 促進腎足突細胞損傷，加重糖尿病腎?。?6］。在人［9］和小鼠［10］中均發(fā)現(xiàn)LncRNA 可能參與胰腺發(fā)育和胰島β細胞分化。LncRNA MEG3在人、小鼠中具有高度同源性，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GAWS）發(fā)現(xiàn)MEG3 是與糖尿病易感性相關(guān)的LncRNA，在2型糖尿病患者胰島中表達顯著下調(diào)。通過在MIN6 細胞中干擾Meg3，發(fā)現(xiàn)Meg3 通過促進Rad21/Smc3/Sin3α的表達，使胰島素合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MafA 表達下調(diào)，從而減少胰島素合成及分泌［17］。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)了LncRNA Lncpint 在小鼠胰島中高表達，促進胰島素合成和分泌，維持胰島β細胞功能［18］；LncRNA TUG1 在小鼠胰腺中低表達，是小鼠發(fā)生2 型糖尿病的重要原因［19］。本研究在IUGR小鼠中也發(fā)現(xiàn)了LncRNA TUG1 表達下調(diào)，LncRNA TUG1 在細胞核中通過綁定PRC2 的催化亞基EZH2，介導EZH2 結(jié)合于Hes1 的啟動子區(qū)，影響H3K27me3 的水平，抑制HES1 的轉(zhuǎn)錄表達，維持胰島β細胞的功能。為深入全面探討LncRNA 在IUGR 胰腺發(fā)育中的作用及機制，對IUGR 新生鼠胰腺進行全轉(zhuǎn)錄組測序及分析。

LncRNA 靶基因和差異mRNA GO 分析中，BP均集中于細胞過程、生物調(diào)節(jié)及代謝過程，CC 集中在細胞及器官等過程，MF 集中于整合、催化活性、轉(zhuǎn)運活性等。這些功能及成分中的基因均可對IUGR 胰島發(fā)育及糖尿病產(chǎn)生影響，例如能量代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等的變化及一些離子通道轉(zhuǎn)運體的變化，這與Rashid等［20］關(guān)于IUGR發(fā)生2型糖尿病的相關(guān)轉(zhuǎn)錄分析一致。

差異LncRNA 靶基因KEEG 分析及差異mRNA KEEG分析表明，PI3K-Akt、Foxo、MAPK通路在IUGR新生鼠中存在明顯表達差異。PI3k-Akt 在增殖、分化、凋亡、葡萄糖代謝等方面均有重要作用，在胰島β細胞中PI3K/Akt 的激活可以促進胰島素的分泌［21］，胰島β細胞中Akt 的過表達和持續(xù)激活可以促進細胞增殖［22］，而Akt 的抑制也會導致胰島素分泌減少［23］。Foxo 可被活性氧（reactive oxygen species，ROS）激活，從而在多種細胞過程如細胞增殖、葡萄糖代謝、細胞周期控制、氧化應激反應等中發(fā)揮作用。在人類IUGR胎兒［24-25］和IUGR鼠［26］中均存在氧化應激和ROS 物質(zhì)的增加。ROS 可以通過抑制MAPK 通路引起細胞死亡的細胞內(nèi)通路［27］，MAPK 通路可以通過ERK1/2 促進孕鼠胰島增殖等［28］。因而這些通路均可能成為IUGR鼠胰腺發(fā)育異常及成年發(fā)生2型糖尿病的可能機制。

經(jīng)過對差異LncRNA 及其靶基因、差異mRNA的GO和KEEG分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA Snhg12、Rian可能分別通過MAPK、PI3K/AKT通路影響胰腺發(fā)育及增殖。LncRNA Snhg12在多種癌癥增殖遷移中發(fā)揮作用，Cao 等［29］指出LncRNA Snhg12 通過與miRNA-320b 的海綿化作用促進胰腺癌細胞增殖、遷移；LncRNA Snhg12 通過激活SIRTI/FOXO3a 抑制自噬和氧化應激改善腦缺血灌注［30］。LncRNA Rian在細胞增殖凋亡中發(fā)揮重要作用，研究表明Rian的過表達會減少細胞凋亡［31］；也可以通過PI3K/AKT 影響細胞增殖［32］。本研究對LncRNA Snhg12 及Rian 在IUGR 新生鼠胰腺中進行了驗證，其表達結(jié)果與測序結(jié)果一致。通過在MIN6細胞中進行不同糖濃度刺激實驗，結(jié)果表明LncRNA Snhg12、Rian表達受糖濃度影響，其可能在IUGR 發(fā)生糖尿病的過程中發(fā)揮作用。測序結(jié)果也預測了LncRNA Snhg12可能會影響Trnau1ap的表達，從而影響胰島發(fā)育及糖尿病發(fā)生；LncRNA Rian 可能通過影響Sky 的表達發(fā)揮作用，具體機制仍需進一步研究。

本研究通過對IUGR新生小鼠及正常新生小鼠轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析，篩選出了差異LncRNA及mRNA，并通過GO、KEEG 分析提出了IUGR 鼠胰島發(fā)育障礙和成年2型糖尿病發(fā)生的可能機制。未來將針對差異表達明顯的LncRNA 在IUGR 胰島發(fā)育異常過程中的機制及功能進行進一步研究。