任耀龍，鄭 剛，趙明君，楊 磊，鐘 偉，齊 婧，劉東敏，徐佳萌，尤金枝，李瑩超

急性心肌梗死是常見的嚴(yán)重威脅人類生命安全的心血管系統(tǒng)急危重癥，臨床治療的首要任務(wù)是盡快開通罪犯血管，恢復(fù)心肌血流灌注。然而，伴隨而來的心肌缺血/再灌注損傷嚴(yán)重制約了病人臨床獲益[1]。腸道菌群被稱為“人體元基因組”，與宿主之間存在密切的信息交流，在代謝、免疫、心血管系統(tǒng)方面的調(diào)控發(fā)揮著重要作用[2]。氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)是食物中膽堿、卵磷脂、左旋肉堿等經(jīng)腸道菌群作用后產(chǎn)生的代表性代謝產(chǎn)物，可促進(jìn)冠心病發(fā)病及不良主要心血管事件發(fā)生[3]。丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛等功效，主治心痛、胃脘諸痛，已廣泛用于冠心病及消化系統(tǒng)疾病的臨床治療，并取得確切的臨床療效[4-5]?；诖耍岢龅嬚{(diào)控腸道菌群保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷的學(xué)術(shù)假說，本研究觀察丹參飲預(yù)處理對SD大鼠在體心肌缺血/再灌注模型腸道菌群的代表性代謝產(chǎn)物TMAO和血清心肌酶、N末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)及心肌組織形態(tài)學(xué)的影響，探討中醫(yī)經(jīng)典名方丹參飲對缺血/再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及對模型動(dòng)物血漿TMAO水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇無特定病原體(SPF)級健康成年SD大鼠50只，雌雄各25只，體質(zhì)量180～210 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 實(shí)驗(yàn)用丹參飲由丹參15 g、檀香15 g、砂仁10 g組成，實(shí)驗(yàn)藥物均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中草藥房。藥物制備：精確稱取生藥40 g，加12倍自來水，浸泡30 min，按質(zhì)量/體積=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)后，藥液以1 000 r/min離心10 min除雜質(zhì)，濃縮為含生藥量1 g/mL，4 ℃下密封冷藏備用。肌酸激酶同工酶(CK-MB)和NT-proBNP試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號(hào)：20191231]，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20191228)，甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 PL3508/P八通道研究型高速記錄系統(tǒng)；SC-5型小動(dòng)物呼吸機(jī)；Bio-Tek ELXSOSIU型全自動(dòng)酶標(biāo)儀；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)；Leica VT1000 S振動(dòng)切片機(jī)；TC-120S+生物組織自動(dòng)脫水機(jī)；TR-180生物組織自動(dòng)染色機(jī)；Nikon TS100-F(配DS-5MC)IX73-U型倒置熒光數(shù)碼顯微鏡；MS105DU半微量電子天平；Direct-Q⑤5純水/超純水一體機(jī)系統(tǒng)；D3024R高速微量冷凍離心機(jī)；JP-040S超聲波清潔器；MX-F旋渦振蕩器；MTV-100多管旋渦混合儀；TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜儀；UlitMate3000rs色譜儀；0.5～10.0 μL、2.0～20.0 μL、20.0～200.0 μL、200.0～1 000.0 μL移液器。

1.4 TMAO檢測方法及條件 從含EDTA的全血中分離出1 mL血漿，置于-80 ℃冰箱凍存待檢。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定血漿TMAO濃度。質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧電離源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓4 000 V；毛細(xì)管溫度350 ℃；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%)；鞘氣：氮?dú)?純度≥99.999%)，40 Arb；輔助氣：氮?dú)?純度≥99.999%)，15 Arb；數(shù)據(jù)采集時(shí)間5 min。色譜條件如下，色譜柱：Waters T3 150×2.1 mm，3 μm，Waters；流速：0.3 mL/min；水相：0.1%甲酸/10 mmol/L甲酸銨；有機(jī)相：0.1%甲酸/乙腈；柱溫箱溫度：40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度/體積：8.0 ℃/5 μL。取血漿50 μL，加入甲醇150 μL，渦旋混勻10 min，以15 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分析?；衔锷V圖采集和積分運(yùn)用軟件Xcilabur 3.0(Thermo)進(jìn)行處理，以1/X2為加權(quán)系數(shù)進(jìn)行線性回歸。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及丹參飲低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，雌雄各5只。給藥方案，假手術(shù)組：給予等體積生理鹽水每日2次，連續(xù)灌服14 d后手術(shù)，只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；模型組：開胸結(jié)扎前降支，余同假手術(shù)組；丹參飲低劑量組(5 g/kg生藥量)、中劑量組(10 g/kg生藥量)、高劑量組(15 g/kg生藥量)，各組均配制成10 mL/kg藥液，每日2次，連續(xù)灌服14 d后手術(shù)。

1.6 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備參考文獻(xiàn)[6]并進(jìn)行改進(jìn)，具體操作方法：大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，將10%水合氯醛以3.5 mL/kg劑量腹腔注射實(shí)施麻醉后仰位固定于動(dòng)物解剖臺(tái)上，正確連接Medlab信號(hào)采集系統(tǒng)，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量2.5 mL，呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2)，觀察穩(wěn)定5 min后于胸骨左緣約0.5 cm處開胸，剪斷第4肋，刺破胸膜充分暴露心臟，剪開心包后將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處高位以0號(hào)手術(shù)線縫針穿過前降支，同時(shí)將直徑1 mm的聚乙烯管置于手術(shù)線與前降支之間，拉緊手術(shù)線使聚乙烯管壓迫前降支造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖ST段抬高>0.1 mV為結(jié)扎成功。心肌缺血45 min后去除聚乙烯管恢復(fù)前降支灌注，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功，再灌注180 min后腹主動(dòng)脈取血，并快速摘取心臟用于心肌組織樣本檢測。假手術(shù)組手術(shù)過程與模型組相同，但只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.7 血液標(biāo)本采集 再灌注3 h后于腹主動(dòng)脈取血，血液標(biāo)本以3 000 r/min離心后取上清液分裝，置于-80 ℃冰箱冷凍備用，實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后嚴(yán)格按照試劑盒操作測定血清LDH、CK-MB、NT-proBNP及TMAO等生化指標(biāo)。

1.8 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理變化 采血后快速摘除心臟，取缺血心肌組織，置于10%甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后進(jìn)行光學(xué)觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型各階段心電圖表現(xiàn) 本研究詳細(xì)記錄了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程各組大鼠心電圖表現(xiàn)。詳見圖1。

圖1 心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠各階段心電圖(A為結(jié)扎大鼠前降支，心電圖表現(xiàn)為ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；B為45 min后取出聚乙烯管給予前降支再灌注，出現(xiàn)再灌注后室性心律失常及Q波；C為再灌注180 min后心電圖表現(xiàn)為ST段回落，病理性Q波形成)

2.2 各組大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丹參飲低劑量組比較，丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丹參飲中劑量組比較，丹參飲高劑量組血清CK-MB、LDH與NT-proBNP水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組及丹參飲預(yù)處理組血漿TMAO表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲預(yù)處理組TMAO表達(dá)均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比較(±s)

2.3 對心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 對大鼠缺血區(qū)心肌進(jìn)行HE染色，觀察各組心肌缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示：模型組心肌紋理紊亂，心肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)明顯被破壞，丹參飲預(yù)處理組可明顯改善這一病理表現(xiàn)，并隨著丹參飲劑量增加，改善作用明顯增強(qiáng)。詳見圖2。

圖2 心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織HE染色圖

3 討 論

隨著人口老齡化程度加劇和居民生活水平的提高，我國心肌梗死發(fā)病率呈升高趨勢，已成為威脅人民生命安全的重大公共衛(wèi)生問題?！吨袊难懿?bào)告2018》數(shù)據(jù)顯示：我國每年有29.5萬人次因心肌梗死住院，2017年我國急性心肌梗死住院總費(fèi)用高達(dá)190.85億元，嚴(yán)重影響國民生活質(zhì)量，增加了病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。心肌梗死的臨床救治以盡早開通罪犯血管，及時(shí)恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流為目標(biāo)。然而，恢復(fù)血流后的心肌缺血/再灌注損傷進(jìn)一步加大心肌梗死面積，誘發(fā)惡性心律失常，降低心功能，是心血管研究領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對心肌缺血/再灌注損傷的具體生理病理機(jī)制開展了大量研究，一般認(rèn)為心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生與細(xì)胞凋亡、心肌能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、氧自由基暴發(fā)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞浸潤等有關(guān)[8]，但確切的病理生理機(jī)制尚不清楚。有研究顯示，腸道菌群的典型代謝產(chǎn)物TMAO與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)，急性冠脈綜合征病人血漿TMAO水平明顯增高[9]。血漿TMAO含量升高與急性冠脈綜合征病人主要不良心臟事件(如心肌梗死、腦卒中、需要血運(yùn)重建)呈正相關(guān)[10]。由此可見，血漿TMAO可能是心肌梗死的潛在治療靶點(diǎn)。

目前，中醫(yī)藥廣泛應(yīng)用于心肌缺血/再灌注損傷的防治，藥理學(xué)已證實(shí)，多種中藥單體及中藥復(fù)方針對心肌缺血/再灌注損傷可有效減少心肌凋亡，減輕心肌細(xì)胞線粒體損傷，調(diào)控自噬過程，調(diào)節(jié)內(nèi)源性一氧化氮表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，多角度發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用[11]。丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，主治心痛及胃脘諸痛，廣泛用于心血管系統(tǒng)及消化系統(tǒng)疾病的臨床治療，是治療心肌梗死的常用經(jīng)典基礎(chǔ)方劑之一，并取得滿意的臨床療效。因此，從腸道菌群角度出發(fā)，提出丹參飲通過調(diào)控腸道菌群改善缺血/再灌注心肌損傷的學(xué)術(shù)假說，采用丹參飲預(yù)處理心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠，探討丹參飲對心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用及對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道菌群代表性代謝產(chǎn)物TMAO水平的影響。

本研究采用前降支結(jié)扎方法制備大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，研究過程可觀察到典型的急性心肌梗死心電圖演變過程，部分大鼠再灌注階段記錄到典型的室性心動(dòng)過速心電圖表現(xiàn)，說明造模成功。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，丹參飲預(yù)處理組血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低(P<0.01)，且隨著丹參飲濃度遞增該表現(xiàn)更顯著，說明丹參飲預(yù)處理可顯著降低心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌酶學(xué)水平，保護(hù)心功能，且高濃度丹參飲保護(hù)作用更顯著。同時(shí)對實(shí)驗(yàn)大鼠缺血區(qū)域心肌細(xì)胞進(jìn)行HE染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果還顯示：模型組心肌紋理紊亂，心肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)明顯被破壞，丹參飲預(yù)處理可明顯改善這一病理表現(xiàn)，且隨著丹參飲劑量增加，改善作用明顯增強(qiáng)，從病理學(xué)角度說明丹參飲預(yù)處理保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞的作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組與丹參飲預(yù)處理組血漿TMAO水平明顯增高，說明結(jié)扎前降支可明顯促進(jìn)模型動(dòng)物血漿TMAO表達(dá)，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步證實(shí)TMAO與心肌梗死的相關(guān)性；但丹參飲預(yù)處理組與模型組大鼠血漿TMAO水平比較均無明顯變化，說明丹參飲預(yù)處理不能降低缺血/再灌注損傷模型大鼠血漿TMAO水平。

綜上所述，本研究從心肌酶學(xué)及病理組織學(xué)角度明確丹參飲預(yù)處理對缺血/再灌注損傷心肌具有確切的保護(hù)作用，并可較好地保護(hù)心功能，但不能降低血漿TMAO水平。本研究從中藥復(fù)方調(diào)控腸道菌群角度出發(fā)，探討丹參飲保護(hù)缺血/再灌注損傷心肌的臨床效應(yīng)機(jī)制，為中醫(yī)藥防治心肌缺血/再灌注損傷開拓了新思路與新方法，今后將以腸道菌群為治療靶點(diǎn)開展中藥單體及中藥復(fù)方防治心血管病的基礎(chǔ)與臨床研究，為中醫(yī)藥調(diào)控腸道菌群防治心血管疾病提供可靠的數(shù)據(jù)支撐和臨床證據(jù)。