范愷磊，王協(xié)和，杜俊潮，李松，張?jiān)铺?，陳盛君?，陳可冀，彭軍，許運(yùn)明

1.江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434；2.江蘇省中藥配方顆粒制備與質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 江陰 214434；3.江蘇省中藥配方顆粒工程技術(shù)中心，江蘇 江陰 214434；4.江蘇省中藥配方顆粒工程研究中心，江蘇 江陰 214434；5.福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350112

鉤藤原名釣藤，始載于《名醫(yī)別錄》，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定鉤藤來(lái)源于茜草科鉤藤屬植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havil.、華鉤藤U.sinensis(Oliv.) Havil.、大葉鉤藤U.macrophyllaWall.、毛鉤藤U.hirsutaHavil.和無(wú)柄果鉤藤U.sessilifrutusRoxb.的帶鉤莖枝，主要分布于廣西、廣東、貴州、福建、江西等地[1]。鉤藤作為常用中藥，具有清熱平肝、息風(fēng)止痙等功效[2]，現(xiàn)代常作為降壓藥配伍使用[3]，也具有神經(jīng)保護(hù)[4]等功效。生物堿是鉤藤中主要活性成分，主要為吲哚生物堿和氧化吲哚生物堿。鉤藤中現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)的吲哚類(lèi)生物堿成分有100多種[5]，有效成分為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等[6-7]。其中鉤藤堿占了總生物堿的28.9%，異鉤藤堿占了總生物堿的14.7%，兩者占了鉤藤總堿的40%以上[8]。因此，以鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿4種生物堿作為鉤藤質(zhì)量控制主要指標(biāo)具有一定合理性，但由于鉤藤中生物堿含量低、對(duì)照品獲得性較難、價(jià)格昂貴，不利于對(duì)鉤藤飲片進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，本研究基于一測(cè)多評(píng)(QAMS)測(cè)定鉤藤中4種生物堿含量，對(duì)于鉤藤飲片的質(zhì)量控制具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料

1.1 儀器

UPLC(美國(guó)沃特世公司)；UPLC(賽默飛世爾科技有限公司)；1260型HPLC儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-250E型超聲清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GKC型控溫水浴鍋(南通華泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Sartoris arium 611 DI型超純水機(jī)(德國(guó)賽多利斯公司)；乙腈(色譜純，ThermoFisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 試藥

對(duì)照品鉤藤堿(批號(hào)：112028-201601，純度≥98%)、異鉤藤堿(批號(hào)：11927-201403，純度≥98%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品去氫鉤藤堿(批號(hào)：ST10570120MG，純度≥98.0%)、異去氫鉤藤堿(批號(hào)：ST11080120MG，純度≥98.0%)購(gòu)于上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。

12批鉤藤飲片均為產(chǎn)地調(diào)研收集樣品，經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司唐波教授鑒定為茜草科植物鉤藤的干燥帶鉤莖枝，其產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 鉤藤樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo Accucore C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，5 μm；100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；以0.02%三乙胺溶液(2%磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5～7.6)-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量為1 μL；理論板數(shù)按異鉤藤堿峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成含鉤藤堿42.10 mg·mL-1、異鉤藤堿39.79 mg·mL-1、去氫鉤藤堿39.80 mg·mL-1、異去氫鉤藤堿40.92 mg·mL-1的混合溶液，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流45 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1專(zhuān)屬性 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、2.3項(xiàng)下供試品溶液、陰性對(duì)照溶液甲醇，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，空白溶劑色譜與對(duì)照品、供試品色譜相對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處均沒(méi)有相應(yīng)的色譜峰，說(shuō)明該方法對(duì)測(cè)定鉤藤飲片中的去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿具有專(zhuān)屬性，無(wú)其他干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A.陰性對(duì)照溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.異去氫鉤藤堿對(duì)照溶液；D.去氫鉤藤堿對(duì)照品溶液；E.異鉤藤堿對(duì)照溶液；F.鉤藤堿對(duì)照溶液；G.鉤藤飲片供試品溶液。圖1 鉤藤飲片供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、4種生物堿類(lèi)成分對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品溶液的UPLC圖

2.4.2線(xiàn)性考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程。結(jié)果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿在相應(yīng)的線(xiàn)性范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4種生物堿類(lèi)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍

2.4.3精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積測(cè)量值，計(jì)算RSD，結(jié)果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿精密度RSD分別為0.16%、0.17%、0.19%、0.32%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取鉤藤飲片(編號(hào)：S3)平行6份，分別按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿峰面積值，計(jì)算其平均含量及 RSD，結(jié)果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿平均含量RSD分別為0.81%、1.70%、0.69%、1.99%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下的樣品(編號(hào)：S3)分別于0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，進(jìn)樣1 μL，測(cè)定峰面積值，計(jì)算其RSD，測(cè)得去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿峰面積的RSD分別為0.58%、0.79%、1.13%、1.42%，結(jié)果表明，所測(cè)定的4個(gè)生物堿類(lèi)成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn) 取鉤藤飲片(編號(hào)：S3)粉末約0.25 g，精密稱(chēng)定，分別加入異去氫鉤藤堿(93.37 μg·mL-1)、去氫鉤藤堿(176.91 μg·mL-1)、異鉤藤堿(143.08 μg·mL-1)、鉤藤堿(71.16 μg·mL-1)對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)得4種成分的加樣回收率，結(jié)果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿加樣回收率均為95%～105%，RSD分別為1.33%、0.25%、0.93%、2.92%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 相對(duì)校正因子(RCF)計(jì)算和相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的確認(rèn)

分別精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，在不同色譜柱、儀器、流速、柱溫條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按QAMS建立的有關(guān)技術(shù)指南[9]，以異鉤藤堿為參照物，計(jì)算其他3種生物堿的RCF與RRT，結(jié)果見(jiàn)表3～6。

2.6 RCF驗(yàn)證

取10批鉤藤飲片，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法、QAMS分別計(jì)算4種生物堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，2種計(jì)算方法結(jié)果接近，RSD<5%，說(shuō)明QAMS所得含量準(zhǔn)確可靠，該含量測(cè)定方法符合方法學(xué)要求，可替代外標(biāo)法，用于鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表3 鉤藤相對(duì)校正因子與相對(duì)保留時(shí)間

表4 不同流速的相對(duì)校正因子與相對(duì)保留時(shí)間

表5 不同柱溫的相對(duì)校正因子與相對(duì)保留時(shí)間

表6 不同儀器的相對(duì)校正因子與相對(duì)保留時(shí)間

表7 鉤藤飲片供試品溶液中4種生物堿類(lèi)成分一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

鉤藤中活性成分主要是生物堿，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿等化學(xué)成分。鉤藤堿與異鉤藤堿，去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿分別為一對(duì)同分異構(gòu)體，均屬于吲哚型生物堿。由于結(jié)構(gòu)接近，較難分離[10]。因此，在流動(dòng)相的選擇中，本實(shí)驗(yàn)嘗試用乙腈-水、甲醇-水，以封端處理的色譜柱進(jìn)行分離，均不能將4種生物堿分開(kāi)；當(dāng)以少量三乙胺為掃尾劑時(shí)，峰形明顯改善，對(duì)稱(chēng)性較好?？紤]到三乙胺對(duì)色譜柱的影響，實(shí)驗(yàn)中也嘗試用氨水代替三乙胺，發(fā)現(xiàn)4種生物堿也能達(dá)到基線(xiàn)分離，但峰形對(duì)稱(chēng)性不及三乙胺。本研究中發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)4種生物堿的分離也有一定影響，當(dāng)pH為7.5～7.6，4種生物堿完全達(dá)到基線(xiàn)分離；當(dāng)pH為7.7～7.9，異去氫鉤藤堿與異鉤藤堿峰逐漸靠近，分離度減小；當(dāng)pH在7.5以下時(shí)，異去氫鉤藤堿與去氫鉤藤堿峰逐漸靠近，鉤藤堿與異鉤藤堿峰逐漸靠近，分離度減小。

目前研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤飲片主要包括五環(huán)單帖吲哚型生物堿、四環(huán)單帖吲哚型生物堿等[11]，其中鉤藤堿與異鉤藤堿占有總生物堿的40%以上，異去氫鉤藤堿與去氫鉤藤堿含量也較高，具有較為明確的藥效。鉤藤在部分方劑中常要求“后下”，有研究表明，其原因可能是鉤藤生物堿不穩(wěn)定所致，受熱易發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此不宜久煎[12]。楊秀娟等[13]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鉤藤中的生物堿在水提取液中60～80 ℃長(zhǎng)時(shí)間加熱情況下穩(wěn)定性較差，加熱過(guò)程中大部分鉤藤堿可以轉(zhuǎn)化為異鉤藤堿，而異鉤藤堿中一部分又可以轉(zhuǎn)化為去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿。目前，中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量控制思路往往更強(qiáng)調(diào)從中藥飲片自身原本含有的化學(xué)成分來(lái)開(kāi)展相關(guān)化學(xué)成分分析檢測(cè)，而較少?gòu)闹嗅t(yī)臨床用藥方式常為煎湯后服用的角度考慮，因此，難以發(fā)現(xiàn)煎煮過(guò)程中化學(xué)成分變化的規(guī)律性，而中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)最終是要為臨床用藥安全性和有效性服務(wù)，有必要兼顧中藥飲片水煎煮過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，更全面地反映中藥原料的質(zhì)量。鉤藤僅以鉤藤堿為檢測(cè)指標(biāo)，并不能很好地控制鉤藤及其制劑的質(zhì)量，本研究選擇以去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、鉤藤堿、異鉤藤堿含量代表鉤藤總生物堿含量，為鉤藤飲片的質(zhì)量控制提供參考。