劉益寧，秦臻，李旋，蔣帥，吳鶴云，謝希賢,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)

嘧啶核苷包括尿嘧啶核苷(尿苷，uridine)和胞嘧啶核苷(胞苷，cytidine)，廣泛應用在食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥等諸多行業(yè)。作為抗病毒抗腫瘤藥物的前體[1]，嘧啶核苷是生物醫(yī)藥研究必不可少的原料。隨著抗病毒抗腫瘤藥物研發(fā)的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不斷拓展，嘧啶核苷的市場需求不斷擴大，迫切需要開發(fā)廉價的可規(guī)模化應用的嘧啶核苷生產(chǎn)工藝。微生物發(fā)酵法具有原料來源廣泛、生產(chǎn)效率高和環(huán)境友好可持續(xù)等諸多優(yōu)勢[2]，是當前嘧啶核苷生產(chǎn)研究的重點。

嘧啶核苷的生物合成可分為3部分(圖1)：首先谷氨酰胺、碳酸氫鹽、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)、天冬氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)等前體物質(zhì)經(jīng)6步酶促反應生成尿苷酸(uridylic monophosphate，UMP)，然后一部分UMP直接脫去磷酸基團生成尿苷，一部分UMP則經(jīng)過一系列的磷酸化，胺化再去磷酸后生成胞苷[3]。該合成途徑會受到嚴謹?shù)恼{(diào)控，如在大腸桿菌中，嘧啶核苷操縱子基因轉(zhuǎn)錄會受到尿苷酸或者胞苷酸的反饋阻遏，且催化第一步反應的氨甲酰磷酸合成酶的活性還受到UMP的反饋抑制[4-5]。另外，胞苷合成的關(guān)鍵酶UMP激酶和三磷酸胞苷(cytidine triphosphate，CTP)合酶的活性還分別受到三磷酸尿苷(uridine triphosphate，UTP)和CTP的反饋抑制[5]。嚴謹?shù)姆答佌{(diào)控機制，冗長復雜的反應過程以及對多種重要前體物的需求是限制嘧啶核苷生物合成的主要因素。早期研究中，通過誘變篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株是選育嘧啶核苷生產(chǎn)菌的主要方法，但是誘變菌株往往存在負向突變的累積，菌株的持續(xù)改良也受限制[6-7]。隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，代謝工程等理性構(gòu)建的方法逐漸成為工業(yè)菌株從頭構(gòu)建和持續(xù)改良的首選方法[8-9]。WU等[4]和FAN等[10]綜合運用高通量篩選和代謝工程的方法構(gòu)建了1株產(chǎn)尿苷的菌株UR6，5 L罐上發(fā)酵64 h，可生產(chǎn)70.3 g/L的尿苷。YANG等[11]通過阻斷降解途徑，促進關(guān)鍵酶的表達，增強前體物的供應等代謝工程策略的運用，成功構(gòu)建產(chǎn)胞苷的工程菌株。但是現(xiàn)存胞苷工程菌株的發(fā)酵性能還較低，很難應用于胞苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

優(yōu)化胞苷合成途徑，構(gòu)建高產(chǎn)胞苷的微生物細胞工廠，逐步提高菌株的胞苷發(fā)酵指標，對胞苷發(fā)酵生產(chǎn)意義重大。課題組前期構(gòu)建的尿苷高產(chǎn)菌UR6的UMP從頭合成途徑已經(jīng)得到了有效強化，本研究接著對UR6的胞苷合成途徑進行了系統(tǒng)的代謝工程改造(圖1)，期望通過強化胞苷合成途徑，將UR6逐步改造為胞苷的高產(chǎn)菌株。主要考察了阻斷胞苷及其前體物的降解途徑，過表達關(guān)鍵酶增強胞苷合成途徑，以及融合蛋白表達改變UMP分別到胞苷和尿苷的流量分配對大腸桿菌嘧啶核苷發(fā)酵的影響，為胞苷高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供新的借鑒和參考。

圖1 嘧啶核苷生物合成途徑和本研究的代謝工程改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of pyrimidine nucleoside and the metabolic engineering strategies used in this study 注：CMP為胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate)；CDP為二磷酸胞苷(cytidine diphosphate)；UDP為二磷酸尿苷(uridine diphosphate)； TCA為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)；PPP為磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所涉及的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究中涉及的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study.

1.2 主要試劑

引物及基因，蘇州金唯智科技有限公司；Primer STAR HS DNA聚合酶，大連寶生物科技有限公司；2×Rapid Taq Mix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA凝膠純化回收試劑盒、胞苷和尿苷標準品，美國Omega公司；其余生化試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 1，蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，NaCl 2.5，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 3，KH2PO4·3H2O 1.2，MgSO4·7 H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，苯酚紅 0.008，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.001。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 4，蛋白胨 5，檸檬酸鈉 2，KH2PO4·3 H2O 2，MgSO4·7 H2O 2， FeSO4·7 H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，苯酚紅 0.008，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.002。

1.4 基因編輯方法

本研究采用LI等[12]報道的CRISPR/Cas9介導的基因組編輯方法進行工程菌株的構(gòu)建。該方法中CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個質(zhì)粒，其中pREDCas9攜帶pGRB的消除系統(tǒng)、λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)及Cas9蛋白表達系統(tǒng)，攜帶奇霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L)，32 ℃培養(yǎng)。pGRB以pUC18為骨架，包含gRNA-Cas9結(jié)合區(qū)域序列和終止子序列，攜帶氨芐青霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)。

1.4.1 pGRB質(zhì)粒和重組片段的構(gòu)建

為構(gòu)建含有不同靶位點序列的重組pGRB質(zhì)粒，首先使用工具CRISPR RGEN Tools選擇靶序列(PAM:5′-NGG-3′)，設計合成2條完全反向互補的單鏈DNA，然后通過退火形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA中間序列是靶位點的特定gRNA間隔序列，兩端序列與pGRB具有同源序列。利用ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，將雙鏈DNA與線性化pGRB通過同源重組構(gòu)建出含有靶點序列的重組pGRB質(zhì)粒。

構(gòu)建重組片段時，先利用引物設計軟件primer 5，以待敲除基因或待整合位點的上下游序列為模板，設計上下游同源臂引物(擴增長度約400～500 bp)。以待整合基因為模板，設計整合基因的擴增引物，擴增上下游同源臂和目的基因片段后，通過重疊PCR的方法連接成重組片段。

1.4.2 DNA片段重組

制備出發(fā)菌株的感受態(tài)細胞，先將pREDCas9質(zhì)?；D(zhuǎn)至感受態(tài)細胞，平板培養(yǎng)并篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性菌株接種到含LB培養(yǎng)基的搖管中培養(yǎng)12 h，再接種于2 XYT培養(yǎng)基(蛋白胨16 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，奇霉素100 mg/L)中培養(yǎng)，待OD600值為0.1～0.2時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，OD600增至0.3～0.4時收集菌體，用10%(體積分數(shù))的甘油洗滌，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將重組pGRB質(zhì)粒和重組片段同時電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，復蘇2 h后涂布在含氨芐青霉素和奇霉素抗性的LB平板上，32 ℃培養(yǎng)。待長出單菌落后，通過菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，再消除pGRB和pREDCas9質(zhì)粒，獲得目標菌株。

1.5 搖瓶培養(yǎng)方法

用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(終體積為30 mL)，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)；發(fā)酵過程中通過補加氨水維持pH值為7.0～7.2；初始葡萄糖耗盡后，補加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行，發(fā)酵周期為24 h。

1.6 檢測方法

利用分光光度計測量發(fā)酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表征生物量；采用HPLC對尿苷和胞苷濃度進行定量分析：所用儀器為Thermo U3000，色譜柱為phenomenex Gemini 5u C18110A(150 mm×4.6 mm)；流動相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；紫外檢測器波長為270 nm。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標準差。利用T檢驗雙尾分布對改造菌和對應出發(fā)菌的2組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。“*”表示P<0.05，說明結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異；“**”表示P<0.01，說明結(jié)果具有極顯著的統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻斷胞苷及前體物降解途徑對嘧啶核苷發(fā)酵的影響

阻斷降解途徑是促使目標產(chǎn)物過量積累的重要方法。胞苷或尿苷可由核苷水解酶(rihA/B/C，UR6中此3個基因已被敲除)水解為胞嘧啶或尿嘧啶，也可被胞苷/尿苷激酶(udk，UR6中此基因也已敲除)磷酸化為CMP和UMP，同胞苷或者尿苷的合成方向相悖[4]。此外，胞苷還可被胞苷脫氨酶(cdd)降解為尿苷[13]。另外，胞苷合成的直接前體物CMP可在核苷酶(ygdH)的作用下降解為胞嘧啶[14]，也可在胞苷酸激酶(cmk)的作用下磷酸化成CDP[15]，是胞苷合成的逆向反應。

分別敲除UR6中的cdd，cmk和ygdH基因，構(gòu)建了菌株CYT1-1，CYT1-2和CYT1-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，搖瓶發(fā)酵24 h后，4株菌的尿苷產(chǎn)量基本相同，且只有CYT1-1積累了0.2 g/L胞苷，說明胞苷脫氨酶的敲除是胞苷積累的關(guān)鍵因素，而cmk基因和ygdH基因的單敲除對發(fā)酵結(jié)果基本無影響。逐一敲除CYT1-1的cmk和ygdH基因后，所得菌株CYT1-4和CYT1-5的胞苷產(chǎn)量分別提高1.3和2.8 g/L，尿苷產(chǎn)量變化不明顯。結(jié)果表明，胞苷脫氨酶催化的反應是胞苷的主要降解途徑，同先前的研究報道相符[11]。而cmk基因和ygdH基因的敲除，切斷胞苷合成主要前體物質(zhì)CMP的主要分支代謝，有利于提高胞內(nèi)CMP的濃度，進而促進胞苷的生成。

圖2 cdd、cmk和ygdH基因的敲除對嘧啶核苷 發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of knockout of cdd, cmk and ygdH genes on pyrimidine nucleoside fermentation 注：“*”代表差異顯著(P<0.05);“**”代表差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.2 加強胞苷合成途徑對嘧啶核苷發(fā)酵的影響

為進一步提高胞苷產(chǎn)量，本研究接著對CYT1-5胞苷合成途徑的主要限速步驟進行了強化。UMP由尿苷酸激酶(pyrH基因編碼)催化生成UDP是UMP合成胞苷的第一個限速步驟，而尿苷酸激酶的催化活性受三磷酸鳥苷 (guanosine triphosphate, GTP)的變構(gòu)激活和UTP的變構(gòu)抑制。研究表明，將大腸桿菌尿苷酸激酶第93位的天冬氨酸替換為丙氨酸可降低該酶與UTP的結(jié)合從而減弱尿苷酸激酶所受的反饋抑制作用[16]。胞苷合成途徑的第二個限速步驟是pyrG基因編碼的CTP合酶所催化的反應，該反應受到CTP的反饋抑制。據(jù)報道，在谷氨酸棒狀桿菌的CTP合酶中引入3個位點的突變(D160E，E162A，E168K)，所得CTP合酶突變體所受CTP的抑制作用大幅減弱[17]。另外，由nudG編碼的CTP二磷酸酶可催化CTP至CMP的反應。強化nudG基因的轉(zhuǎn)錄表達理論上也有利于胞苷的生成。

本研究首先在CYT1-5中的ilvG、tehB和yeeP3個假基因位點分別整合了PyrHecj(D93A)、PyrGcgl(D160E、E162、E168K)的編碼基因pyrH*和pyrG*，以及nudG基因，并都由啟動子Ptrc啟動，構(gòu)建了菌株CYT2-1、CYT2-2和CYT2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，CYT2-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.2和7.4 g/L，相比于CYT1-5，胞苷產(chǎn)量提高了50%，尿苷產(chǎn)量降低了35.1%。另外，CYT2-1的OD600值為27.5，較CYT1-5降低了29%；CYT2-2的發(fā)酵結(jié)果同CYT1-5基本無變化；CYT2-3的胞苷產(chǎn)量為4.4 g/L，較CYT1-5提高了57.1%，而尿苷產(chǎn)量和OD600值與CYT1-5相比基本無變化。結(jié)果表明，PyrHecj(D93A)的表達有效促進了胞苷的積累，但是中間代謝物如UDP或UTP的濃度也可能提高，從而造成代謝不平衡妨礙了菌體的生長；PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)在CYT1-5中的表達對其嘧啶核苷的發(fā)酵基本無影響，分析可能是底物UTP供應不足，于是本研究對PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)進行了組合表達，構(gòu)建了菌株CYT2-4，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，CYT2-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.9和8.4 g/L，相較于CYT2-2，胞苷產(chǎn)量有了顯著提升，而尿苷產(chǎn)量和菌體生長情況也得以恢復，說明這2個酶的組合過表達更有利于胞苷合成途徑的強化，有效促進了胞苷的積累。最后在CYT2-4上對nudG基因進行了雙拷貝，構(gòu)建了菌株CYT2-5，搖瓶結(jié)果顯示CYT2-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.6和9.3 g/L，OD600值為34.5。相較于CYT2-4，CYT2-5的胞苷產(chǎn)量提升了14.3%，尿苷產(chǎn)量提升了12.0%，菌體生長基本無變化。

圖3 pyrH*、pyrG*和nudG基因的整合對 嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of integration of pyrH*、pyrG* and nudG genes on pyrimidine nucleoside fermentation

突變體PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)的組合表達以及內(nèi)源nudG基因表達的強化有效促進了胞苷的積累。但是盡管胞苷產(chǎn)量得到了顯著提升，CYT2-5中主要產(chǎn)物仍舊是尿苷，需進一步改變UMP的流量分配，將更多地UMP導向胞苷的合成。

2.3 5′-核苷酸酶對嘧啶核苷發(fā)酵的影響

從前述結(jié)果來看，在嘧啶核苷合成代謝中，尿苷是優(yōu)先合成的，原因可能有兩方面：一是因為胞苷合成的直接前體CMP來源于尿苷合成的直接前體UMP，且UMP向CMP的合成還受到嚴謹?shù)恼{(diào)控，因此相比CMP，胞內(nèi)更容易積累UMP，從而有利于尿苷的合成；二是大腸桿菌中，5′-核苷酸酶的專一性較弱，嘌呤和嘧啶核苷酸都可被5′-核苷酸酶催化生成相應的核苷，而且相對于胞苷酸，大腸桿菌中的5′-核苷酸酶可能對UMP的親和力更強，因此在前體物UMP充足的條件下，細胞更容易積累尿苷。選擇對UMP親和力較弱，而對CMP具有更高親和力，甚至專一性結(jié)合CMP的5′-核苷酸酶會更有利于胞苷的合成。

大腸桿菌中已被注釋的編碼5′-核苷酸酶的基因有4個,分別是ushA、yrfG、yjjG和surE。為了驗證這4個基因所編碼的4種5′-核苷酸酶對UMP和CMP的親和力，本研究首先將CYT2-5中ushA、yrfG、yjjG和surE4個基因進行了組合敲除，構(gòu)建了只含1種5′-核苷酸酶的菌株CYT3-1、CYT3-2、CYT3-3和CYT3-4。搖瓶結(jié)果如圖4所示，由于3個5′-核苷酸酶基因的敲除會導致胞內(nèi)5′-核苷酸酶活力大幅降低，所以相對CYT2-5，4株菌的胞苷和尿苷產(chǎn)量都顯著降低，而且4株菌的胞苷產(chǎn)量在總的嘧啶核苷產(chǎn)量的占比也都呈現(xiàn)了明顯的降低趨勢，說明菌株自身的4種5′-核苷酸酶都對UMP表現(xiàn)出了更高的親和力。

圖4 不同5′-核苷酸酶對嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different 5′-nucleotidases on pyrimidine nucleoside fermentation

XU等[18]的研究報道指出，來源于酵母菌的5′-核苷酸酶(phm8基因編碼)對CMP的親和力更強，于是本研究在CYT2-5的假基因mbhA位點上整合了酵母菌的phm8基因，構(gòu)建了菌株CYT3-5，發(fā)酵結(jié)果顯示，CYT3-5的尿苷產(chǎn)量為11.5 g/L，較CYT2-5提高了23.7%，但是胞苷產(chǎn)量變化不大。和XU等[18]的研究報道不同，5′-核苷酸酶PHM8在大腸桿菌中的表達顯著提高了尿苷的產(chǎn)量，可能的原因是CYT3-5胞內(nèi)UMP的濃度遠高于CMP的濃度，UMP會競爭性地與PHM8結(jié)合，從而有利于尿苷的生成。

2.4 融合蛋白的表達對嘧啶核苷發(fā)酵的影響

由于本研究所用出發(fā)菌株含有2個PyrF編碼基因，來源于枯草芽孢桿菌的pyrFbsu基因以及本源的pyrFecj基因，所以分別敲除CYT3-5中的pyrFbsu基因和pyrFecj基因，構(gòu)建了菌株CYT4-1和CYT4-2，以驗證這2個基因?qū)︵奏ず塑蘸铣伤鸬淖饔?。搖瓶結(jié)果如圖5所示，3株菌的生長情況基本相同；相比于CYT3-5，CYT4-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量變化不大，而CYT4-2的胞苷產(chǎn)量和尿苷產(chǎn)量都有了顯著下降，表明CYT3-5自身的PyrF對嘧啶核苷合成起主要的作用。于是本研究選擇將PyrFecj同尿苷酸激酶突變體PyrHecj(D93A)進行了融合表達?？紤]到融合蛋白中2個功能蛋白在表達過程中的先后順序?qū)φw催化效率的影響，本研究構(gòu)建了2個融合蛋白：PyrFecj-(Gly4Ser)3-PyrHecj(D93A)和PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj。對應的編碼基因分別為pyrFecj-[(GGT)4(TCA)]3-pyrH*和pyrH*-[(GGT))4(TCA)]3-pyrFecj(前一個蛋白編碼基因的終止密碼子已去除)。將這2個基因分別整合在CYT4-2的假基因yjiT位點，并由啟動子Ptrc啟動，構(gòu)建了菌株CYT4-3和CYT4-4。另外在CYT3-5中的相同位點整合了pyrH*基因，構(gòu)建菌株CYT4-5。將CYT3-5、CYT4-3、CYT4-4和CYT4-5進行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示，這幾株菌的生長情況基本無差別；CYT4-3的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.9和11.9 g/L，和CYT3-5相比，胞苷產(chǎn)量提高了7.2%，尿苷產(chǎn)量降低了6.1%；CYT4-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為7.2和8.2 g/L，和CYT3-5相比，胞苷產(chǎn)量提高了30.9%，尿苷產(chǎn)量降低了28.7%；CYT4-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為6.2和8.8 g/L，較CYT3-5相比，胞苷產(chǎn)量提高了14.8%，尿苷產(chǎn)量降低了23.5%。

圖5 PyrF和PyrH融合表達對嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fusion expression of PyrF and PyrH on pyrimidine nucleoside fermentation

結(jié)果表明，pyrH*基因表達的強化和融合蛋白的表達，都有利于UMP流向胞苷的合成，從而促進胞苷的積累，降低尿苷的合成。比較而言，融合蛋白的表達對胞苷的合成更有利，且PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj的表達效果更好。融合蛋白的表達之所以比pyrH*基因的單獨過表達效果更為顯著，原因可能在于pyrH*基因的單獨過表達只是通過提高胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量，促進UMP流向胞苷的合成，而融合蛋白的表達不僅增加了胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量，還通過融合蛋白所具有的“鄰近效應”使PyrHecj(D93A)與其相融合的PyrFecj所催化的產(chǎn)物UMP有更高的碰撞幾率，從而更有效地促進了胞苷合成前體物UTP的合成，顯著促進了胞苷的積累，相應地，UMP流向尿苷的合成通量顯著降低。

3 討論與結(jié)論

UR6是1株經(jīng)過系統(tǒng)代謝工程改造所得的尿苷高產(chǎn)菌株，其UMP合成途徑較強，適合作為構(gòu)建胞苷高產(chǎn)菌株的出發(fā)菌株。為將UR6由只產(chǎn)尿苷的菌株改造為胞苷高產(chǎn)菌，本研究從4個方面入手，對UR6的胞苷合成途徑進行了系統(tǒng)改造。

(1)阻斷胞苷及其前體物的降解途徑。cdd基因的敲除切斷了胞苷的主要降解途徑，使菌株開始積累胞苷。cmk基因和ygdH基因的敲除切斷了胞苷合成途徑中的主要支路途徑，減少了胞苷合成前體物的額外消耗，也促進了胞苷的積累。(2)組合強化胞苷合成關(guān)鍵酶的表達。本研究引入了調(diào)控作用減弱的UMP激酶和CTP合酶突變體，并對本源的CTP二磷酸酶的編碼基因進行了雙拷貝，通過關(guān)鍵酶的組合表達有效地加強了胞苷的合成途徑，使得胞苷的產(chǎn)量大幅提升。(3)比較不同5′-核苷酸酶對嘧啶核苷發(fā)酵的影響。尿苷和胞苷合成途徑的競爭主要在于5′-核苷酸酶所催化的反應。本研究構(gòu)建了只含其中1種5′-核苷酸酶的菌株，考察了大腸桿菌自身的4種核苷酸酶分別在嘧啶核苷發(fā)酵中所起的作用。結(jié)果證實這4種核苷酸酶的專一性較差，并且相對于CMP，4種核苷酸酶都更傾向于和UMP結(jié)合,從而催化其合成尿苷。PHM8是來源于酵母菌的5′-核苷酸酶，先前有報道稱其對CMP有更高的親和力。但是和報道的結(jié)果不同，該酶在大腸桿菌的表達，顯著促進了尿苷的積累，而對胞苷積累的影響不大。說明在UMP相對過量的條件下，PHM8還是優(yōu)先結(jié)合UMP，催化其生成尿苷。(4)通過蛋白的融合表達增強胞苷合成。本研究將乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶同尿苷酸激酶進行融合表達，利用融合蛋白的“鄰近效應”，促進前體物UMP流向胞苷的合成，使胞苷的產(chǎn)量得到了顯著提升。

最終所得菌株CYT4-4搖瓶發(fā)酵24 h可積累7.2 g/L胞苷和8.2 g/L尿苷，說明本研究通過對胞苷合成途徑的一系列改造，成功改變了UMP向胞苷和尿苷合成的流量分配，使約46.7%的UMP流向了胞苷的合成。多種可分離產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)是提高原料利用率、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的有效方法[24]。胞苷和尿苷可以通過色譜分離等技術(shù)進行分離純化，因此該菌可用來聯(lián)產(chǎn)尿苷和胞苷，具有一定的工業(yè)化應用價值。為進一步提升胞苷產(chǎn)量，最終獲得只高產(chǎn)胞苷的工程菌，需要繼續(xù)強化菌株的胞苷合成途徑，如篩選對CMP有更高親和力甚至專一親和CMP的5′-核苷酸酶和完全解調(diào)控的UMP激酶和CTP合酶等。