王 梓，梁俊彬，侯 強，虞 霄，劉一州，宋春梅，劉 敏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013)

失眠癥是現(xiàn)今社會的普遍現(xiàn)象,它不僅會影響人們夜間的休息,還會導(dǎo)致記憶力下降，嚴(yán)重影響到白天的正常工作與生活[1]。五味子按照產(chǎn)地分為北五味子和南五味子。北五味子的外形多呈腎形，有油亮光澤，表皮較為薄而脆，果肉可聞到微香，入口味酸，它具有改善血液循環(huán)、止咳化痰、降低血壓、保護心臟和肝臟的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)：五味子中的黃酮化合物和五味子素等具有廣泛抑制中樞神經(jīng)活動的作用，同時還具有安神的作用[4-5]。本研究探討五味子酒對小鼠的睡眠以及記憶方面是否具有改善作用，為五味子酒的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

五味子產(chǎn)地為吉林。雄性昆明小鼠，體重25～30 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

熒光分光光度計(960CRT上海精密科學(xué)儀器有限公司)；粉碎機(SF-130B泰州市精密科學(xué)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5220上海亞榮儀器有限公司)；Morris水迷宮(XR-XM101-X1上海欣軟儀器設(shè)備有限公司)。

多巴胺(DA)、五羥色胺(5-HT)、五羥吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 五味子酒的制備及成分測定

稱取新鮮五味子1.5 kg、單晶冰糖1 kg與雙蒸水6 L混合28 ℃發(fā)酵一個月。酒精計測定酒精度(20 ℃)為(10.06±0.26)%(v/v)；糖度計測定糖度為(250.8±0.5)g/L。亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定主要活性成為分水溶性黃酮，含量為(41.0±3.5)g/L。使用前用生理鹽水稀釋到所需濃度。

1.3 小鼠的分組以及給藥

50只健康成年雄性昆明小鼠隨機分成5組，分別為空白對照組(生理鹽水)，陽性對照組(地西泮2.5 mg/kg)，五味子酒低、中、高劑量組(五味子酒6.25、12.5、25 mg/kg)。每組10只，灌胃量10 mL/kg[6]。分組后給予對應(yīng)的受試物，陽性對照組在最后1天一次性給予2.5 mg/kg的地西泮，其他組連續(xù)灌胃30 d。

1.4 睡眠實驗

1.4.1直接睡眠實驗

末次給藥后將小鼠輕輕放置于背臥位，觀察其翻正反射是否消失。翻正反射以小鼠置于背臥位60 s不翻轉(zhuǎn)為標(biāo)準(zhǔn)。如果消失，記錄其睡眠時間以及入睡的小鼠數(shù)量[7]。

1.4.2戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗

末次給藥30 min后各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg，注射量為10 mL/kg，觀察30 min以內(nèi)的小鼠睡眠情況，以翻正反射消失60 s為標(biāo)準(zhǔn)，記錄小鼠入睡的數(shù)量，計算小鼠睡眠發(fā)生率[8]。

1.4.3延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗

末次給藥30 min后各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg/kg，注射量為10 mL/kg，使小鼠背臥位置，翻正反射消失60 s為標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組小鼠睡眠潛伏期以及睡眠時間[9]。

1.5 小鼠記憶實驗

Morris水迷宮實驗檢測小鼠的記憶能力，水溫(22±1)℃，實驗室密封，保證水池水面上沒有光影。

1.5.1定位航行實驗

實驗進行4 d，每天進行4次，每次1 min。實驗前1天將小鼠放入水迷宮中自由適應(yīng)2 min。實驗開始時將平臺至于水迷宮東北象限，小鼠依次從池壁四個象限放入水中，記錄其尋找到平臺并保持15 s的潛伏期。如果1 min內(nèi)沒有找到平臺就將其引導(dǎo)至平臺，并保持15 s，潛伏期記錄為60 s。記錄4 d小鼠的逃避潛伏期并計算其平均值。

1.5.2空間探索實驗

于定位航行實驗結(jié)束后的次日進行。將東北角平臺移除，將小鼠依次放入水迷宮，記錄小鼠在東北象限的停留時間以及穿越平臺位置的次數(shù)[10]。

1.6 小鼠腦中三種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測

實驗結(jié)束后將小鼠斷頭處死，立即取腦組織400 mg，放入勻漿管中并加入10倍體積冰的酸性正丁醇勻漿，按照ELISA試劑盒說明書按步驟檢測DA、5-HT、5-HIAA的含量[11]。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠睡眠實驗

各組小鼠連續(xù)灌胃30 d，直接睡眠實驗時，翻正反射仍然存在，入睡小鼠數(shù)量為0，沒有發(fā)生直接睡眠的狀況發(fā)生，說明了五味子酒對于小鼠沒有直接的睡眠影響。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗中空白對照組，陽性對照組，五味子酒低、中、高劑量組小鼠入睡數(shù)分別為1、9、7、7、8只，各組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明五味子酒對小鼠睡眠有影響。

在延長戊巴比妥鈉睡眠持續(xù)期實驗中，從注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期，翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時間為睡眠持續(xù)期。由表1可以看出，與空白對照組比較，各組小鼠的睡眠潛伏期都縮短，睡眠持續(xù)期都延長。其中，陽性對照組，五味子酒中、高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明五味子酒能延長戊巴比妥鈉致小鼠睡眠持續(xù)期。

表1 小鼠睡眠潛伏期與睡眠持續(xù)期

2.2 小鼠記憶實驗結(jié)果

2.2.1定位航行實驗

由表2可見，在定位航行實驗中，小鼠對周圍環(huán)境有個熟悉辨認(rèn)的過程，所有分組第一天到第四天逃避潛伏期依次縮短，其中高劑量組逃避潛伏期與空白對照組逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且低、中、高三個劑量組的逃避潛伏期依次縮短。實驗結(jié)果表明，五味子酒對小鼠記憶有改善作用。

表2 小鼠逃避潛伏期

2.2.2空間探索實驗

由表3可見，與空白對照組相比較，各劑量組小鼠穿越平臺的次數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，穿越平臺的次數(shù)是依次增加的。與空白對照組比較，中、高劑量組小鼠在東北象限停留的時間也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)合定位航行實驗可以證明，五味子酒水提液對小鼠記憶具有改善功能，且高劑量組更為明顯。

2.3 神經(jīng)遞質(zhì)檢測結(jié)果

由表4可以看出，與空白對照組相比較，五味子酒各劑量組腦組織中DA含量隨著劑量增加而增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義；腦組織中5-HT和5-HIAA含量隨著五味子酒的劑量增加而增加，在高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

五味子的主要有效成分為木脂素類和黃酮類，具有廣泛的中樞神經(jīng)活動抑制功能，并且具有安定神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的作用和特點[12]。目前關(guān)于五味子類保健食品開發(fā)較少。本研究探討五味子酒改善睡眠和記憶的功效。研究通過睡眠實驗驗證了五味子酒對于睡眠狀況的改善情況，而睡眠質(zhì)量和記憶能力緊密相關(guān);通過Morris水迷宮實驗來判斷五味子酒對于小鼠記憶的影響，該實驗是目前世界公認(rèn)的較為客觀的學(xué)習(xí)記憶功能的評價方法[13]。神經(jīng)遞質(zhì)DA和睡眠與覺醒有關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)有關(guān)聯(lián)。當(dāng)小鼠腦內(nèi)DA濃度升高時，其腦電波出現(xiàn)興奮的表現(xiàn)，睡眠困難；DA濃度降低時，小鼠睡眠困難減輕[14]。神經(jīng)遞質(zhì)5-HT是參與睡眠與覺醒機制公認(rèn)的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)之一，對于睡眠的發(fā)生和維持起著及其重要的作用，目前被認(rèn)為是小鼠腦內(nèi)的“致眠因子”；反之，5-HT濃度降低是引起小鼠失眠發(fā)生的重要指標(biāo)之一。神經(jīng)遞質(zhì)5-HIAA是小鼠腦內(nèi)5-HT的主要代謝產(chǎn)物。5-HIAA濃度的增加，直接表明5-HT的合成和代謝的增加，促進小鼠睡眠發(fā)生[14]。本實驗研究結(jié)果提示，五味子酒通過提高小鼠腦中5-HT和5-HIAA的含量進而促進小鼠睡眠發(fā)生，提高小鼠記憶水平。

表3 小鼠空間探索實驗

表4 小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量