張陸 劉志昂 姜巖 劉軍

鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

膝骨關節(jié)炎為一種退行性病變，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的膝關節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關節(jié)腫脹、活動受限和關節(jié)畸形等。隨著人口老齡化的不斷加劇，膝骨關節(jié)炎的發(fā)病率不斷增高，目前尚無有效的治療方法。臨床上常用的治療方法是通過關節(jié)腔注射潤滑劑或應用非甾體抗炎藥，以緩解患者的痛疼及相關癥狀，晚期患者可以采取關節(jié)置換等手術治療[1]。盡管如此，還是不能對軟骨損傷及炎癥進程進行逆轉[1]。干細胞抑制治療是骨關節(jié)炎的一種新的治療手段。間充質干細胞(MSCs)為一種多能干細胞，自我更新和多向分化能力強，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞[2]。骨髓來源間充質干細胞(BMSCs)是研究較早的一種MSCs，但是由于來源有限且取材具有侵襲性，已被其他來源MSCs逐漸取代。hUC-MSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題限制的特征，有可能成為BMSCs的理想替代物[3]。iPSC-MSCs是一種新型干細胞，是成熟體細胞通過轉錄重編、培養(yǎng)、擴增誘導成的MSCs，相對于傳統(tǒng)的干細胞，其增殖潛能更大，可能是一種很有前途的替代細胞來源[4]。因此，本研究將基于動物實驗，探討iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關節(jié)炎的治療作用及可能機制，為臨床干細胞移植治療骨關節(jié)炎提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠50只，雌雄各半，重量為170 ～210 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYDWXK(豫)2018-011，合格證號：344002837650。

1.1.2藥品與試劑：iPSC-MSCs由河南金泰生物技術股份有限公司提供，IPMC批號：2018110432，規(guī)格：4×108個細胞/mL；hUC-MSCs由河南金泰生物技術股份有限公司提供，批號：UMC2018091466，規(guī)格：4×108個細胞/mL，經(jīng)鑒定iPSC-MSC與hUC-MSCs均為第3代次細胞；玻璃酸鈉注射液由華煕福瑞達生物醫(yī)藥有限公司生產，批號：20181085H，規(guī)格：25 mg:2.5 mL/支；抗MMP-13多克隆抗體、抗CollagenⅡ多克隆抗體、抗ADAMTS-5多克隆抗體均由Abcam公司提供，批號分別為ab1846、ab1890、ab1822。

1.2 方法

1.2.1膝骨關節(jié)炎模型的建立：SD大鼠禁食12 h后采用Hulth法建立膝骨關節(jié)炎模型。將大鼠麻醉后仰臥于臺上，對右側后肢膝關節(jié)進行常規(guī)消毒，在髕骨旁的內側將膝關節(jié)切開，顯露，將內側副韌帶切斷后將關節(jié)腔進行打開；將內側的半月板切除；在手術中保證關節(jié)面沒有受到損傷。止血后對切口進行縫合。假手術組不切斷前后交叉韌帶、內側副韌帶及半月板。術后每只大鼠給予肌注青霉素20萬IU，1次/d，共3 d。術后1周，對每只大鼠進行運動訓練，加重膝骨關節(jié)炎。

1.2.2分組與給藥：按照隨機數(shù)字法將50只SD骨關節(jié)炎模型大鼠分為模型組、iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組、玻璃酸鈉組、假手術組，每組10只。模型組與假手術組通過關節(jié)腔注射50 μL的生理鹽水；iPSC-MSCs組與hUC-MSCs組分別通過關節(jié)腔注射50 μL(2×106個細胞/mL)的iPSC-MSCs (4×108個細胞/mL)與hUC-MSCs (4×108個細胞/mL)；玻璃酸鈉組通過關節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液，50 μL/次，1次/周，共5次。將所有大鼠在給藥5周后予以處死。

1.2.3觀察指標：①膝關節(jié)直徑差值：采用游標卡尺對術側膝關節(jié)與對側膝關節(jié)的直徑進行測量，計算差值；②膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級的評價：給藥1周后，對每組大鼠術側膝關節(jié)進行X線檢查，采用Kellgren-Lawrence分級評分系統(tǒng)評價膝骨關節(jié)炎的嚴重程度，從輕到重分為：0級(正常的膝關節(jié))、I級、II級、III級、IV級(最嚴重程度的膝骨關節(jié)炎)；③膝關節(jié)Pelletier評分：處死大鼠后取其膝關節(jié)，在顯微鏡下對關節(jié)腔內的軟骨退變情況進行觀察，進行膝關節(jié)Pelletier評分，評分越高表示軟骨受到損傷的程度就越高；④膝關節(jié)病理組織學評分：處死大鼠后取其股骨內髁關節(jié)面，經(jīng)處理后采用Mankin標準進行病理組織學評分，評分越高表示軟骨結構受到破壞的程度就越高；⑤MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的檢測：處死大鼠后取其膝關節(jié)，采用免疫組織化學法檢測大鼠膝關節(jié)MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組膝關節(jié)直徑差值的比較

與假手術組比較，模型組的膝關節(jié)直徑差值[(2.45±0.62) mm]明顯增大，膝關節(jié)發(fā)生變形，說明膝骨關節(jié)炎模型建立成功。iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關節(jié)直徑差值分別為(1.10 ±0.38) mm、(1.29 ±0.46) mm、(1.50±0.35) mm，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間的的膝關節(jié)直徑差值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級的比較

與假手術組比較，模型組膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級均明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，iPSC-MSCs組的膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯優(yōu)于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級情況

2.3 各組膝關節(jié)Pelletier評分的比較

與假手術組比較，模型組的膝關節(jié)Pelletier評分[(3.35±0.77)分]明顯增高(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關節(jié)Pelletier評分分別為(1.19±0.53)分、(2.08±0.60)分、(1.99±0.59)分，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組的膝關節(jié)Pelletier評分均明顯低于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 各組膝關節(jié)病理組織學評分的比較

各組膝關節(jié)病理組織學檢測結果見圖1。假手術組、iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組膝關節(jié)的骨組織表現(xiàn)正常，軟骨細胞呈較為均勻地分布，潮線表現(xiàn)為完整且平滑；模型組膝關節(jié)的軟骨邊緣出現(xiàn)部分缺損，軟骨細胞成簇分布，排列比較紊亂，可見炎性細胞浸潤，潮線漂移。

圖1 各組膝關節(jié)病理組織學檢測結果 (HE染色×100)

與假手術組比較，模型組的膝關節(jié)病理組織學評分[(5.46±1.33)分]明顯增高(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關節(jié)病理組織學評分分別為(1.80±0.47)分、(3.32±1.15)分、(3.90±1.20)分，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組的膝關節(jié)病理組織學評分均明顯低于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 各組MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的比較

與假手術比較，模型組的CollagenⅡ水平明顯降低(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯升高(P<0.05)。iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組的CollagenⅡ水平明顯高于模型組(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯低于模型組(P<0.05)；iPSC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯低于hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組(P<0.05)；hUC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于玻璃酸鈉組(P<0.05)，兩組之間MMP-13與ADAMTS-5水平的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5表達水平的比較

3 討論

膝骨關節(jié)炎是以關節(jié)軟骨發(fā)生缺失、關節(jié)軟骨基質發(fā)生降解等為主要特征的一種退行性關節(jié)疾病，其病理生理機制比較復雜，大多數(shù)學者[5]認為是機械性與生物性因素共同作用的結果。關節(jié)軟骨細胞及基質的合成與降解發(fā)生紊亂，是造成膝骨關節(jié)炎的重要關鍵[6]。Hulth法是建立膝骨關節(jié)炎動物模型的經(jīng)典方法，膝骨關節(jié)炎動物模型的特點與人自發(fā)性膝骨關節(jié)炎的病理生理比較相似[7]，因此常被用于動物基礎實驗研究。

hUC-MSCs具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化。有報道[8]指出，從人臍帶中分離出的MSCs，其細胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便、無倫理學爭議等優(yōu)點，越來越受到研究工作者們的關注。iPSCs是通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為的多能性干細胞，iPSCs技術可以用患者自己的體細胞制備專有的干細胞，從而大大降低了免疫排斥反應發(fā)生的可能性[9]。iPSC-MSCs的岀現(xiàn)，在干細胞、表觀遺傳學以及生物醫(yī)學等研究領域都引起了強烈的反響，使人們對多能性的調控機制有了突破性的新認識，進一步拉近了干細胞與臨床疾病治療之間的距離[10]。

本文基于動物實驗，探討iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關節(jié)炎的治療作用及可能機制。結果顯示，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均能明顯降低膝骨關節(jié)炎大鼠的膝關節(jié)直徑差值、膝關節(jié)Pelletier評分、膝關節(jié)病理組織學評分，改善膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級；iPSC-MSCs組膝關節(jié)Pelletier評分、膝關節(jié)病理組織學評分均明顯低于hUC-MSC組，膝關節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯優(yōu)于hUC-MSC組。說明iPSC-MSCs與hUC-MSCs能夠對術后關節(jié)不穩(wěn)起到明顯的緩解作用，有效地保護膝關節(jié)面之間摩擦而引起的骨質增生和硬化；能夠對關節(jié)腔結構、減少骨贅形成和骨質硬化起到明顯的改善作用；能夠明顯減少軟骨層缺損，改善潮線完整度，修復后的軟骨具有與正常軟骨相似的典型透明特征。提示，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均對大鼠膝骨關節(jié)炎具有明顯的治療作用，iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs。

CollagenⅡ主要由軟骨細胞產生，是一種高分子蛋白質，絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網(wǎng)狀結構，產生一定的機械強度[11]；MMP-13可降解多種軟骨細胞外基質成分，能作用于CollagenⅡ，MMP-13水平增高可促進其網(wǎng)狀結構發(fā)生裂解，造成關節(jié)軟骨發(fā)生缺損[12-13]；ADAMTS-5能夠通過對aggrecan(一種關節(jié)軟骨基質的組成成分，對保持軟骨的彈性及完整性具有重要作用)進行降解而損傷軟骨結構的完整性及關節(jié)功能，與膝骨關節(jié)炎的嚴重程度呈現(xiàn)正相關性[14-15]。本研究中，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均能明顯增高膝骨關節(jié)炎大鼠的CollagenⅡ水平，降低MMP-13與ADAMTS-5水平，而iPSC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于hUC-MSCs組、MMP-13與ADAMTS-5水平明顯低于hUC-MSCs組，說明iPSC-MSCs與hUC-MSCs均上調大鼠膝關節(jié)軟骨基質中CollagenⅡ的表達水平，下調MMP-13與ADAMTS-5的表達水平，抑制軟骨的降解，起到保護軟骨的作用，而iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs。

綜上所述，iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關節(jié)炎具有明顯治療作用，iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs，其作用機制可能與上調CollagenⅡ水平及下調MMP-13、ADAMTS-5水平有關。