伍少欽 ， 秦榮香 ， 陸 江 ， 盧 劍 ， 肖有恩 ， 蔣志疆 ， 謝露露 ， 吳志君

(廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司 ， 廣西 南寧 530022)

豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大豬病之一，每年給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬瘟不僅影響種豬場(chǎng)本身豬群健康，同時(shí)影響母豬繁殖性能和對(duì)外銷售種豬的健康度。良圻原種豬場(chǎng)作為種豬生產(chǎn)企業(yè)，十分重視豬瘟的控制和凈化工作，由專人負(fù)責(zé)制訂豬瘟控制與凈化實(shí)施方案，2005年10月在核心種豬場(chǎng)(第二原種豬場(chǎng)，基礎(chǔ)母豬規(guī)模1 200頭)開展豬瘟逐步控制與凈化方案的試點(diǎn)工作。方案中以檢測(cè)豬瘟病毒，淘汰免疫缺陷和免疫耐受的種豬； 必要時(shí)用免疫熒光抗體或RT-PCR等方法檢測(cè)豬瘟病毒。為做到核心群(場(chǎng))的豬瘟凈化，公司全體技術(shù)人員在豬場(chǎng)生物安全體系建設(shè)、豬瘟疫苗篩選、免疫程序制定和完善、核心種豬群的多次全群檢測(cè)、所有后備豬抗體的合格準(zhǔn)入、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)建設(shè)(增加設(shè)備設(shè)施、篩選和比較檢測(cè)試劑和方法)等方面開展大量工作。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬瘟抗原、抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒(抗體試驗(yàn)盒判定標(biāo)準(zhǔn):阻斷值<30 為陰性;31～40為可疑;阻斷值>40為陽(yáng)性)，購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；豬瘟疫苗，購(gòu)自國(guó)內(nèi)多家公司。

1.2 主要儀器 檢測(cè)儀器包括不同規(guī)格的微量移液器 (瑞士SOCOREX、美國(guó)EPPENDORF 等)、美國(guó) Biotek ELX 800 酶標(biāo)儀、英國(guó)UVI凝膠成像系統(tǒng)、日本TaKaRa TP600 梯度PCR儀、美國(guó)Baker生物安全柜、微量振蕩器(IKA)、高速離心機(jī)、離心管、一次性采血器等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斷奶仔豬、保育豬、育肥豬、后備豬和生產(chǎn)母豬等，良圻原種豬場(chǎng)自繁自養(yǎng)。

1.4 豬瘟凈化主要原理和方案 如果一個(gè)豬群體里持續(xù)多年保持沒有豬瘟易感個(gè)體，就清除了豬瘟。首先，基礎(chǔ)豬群的豬瘟抗體陽(yáng)性率要在85%以上；第二，豬瘟抗體不合格個(gè)體補(bǔ)免疫苗6周后要達(dá)標(biāo)，否則做淘汰處理；第三，補(bǔ)充后備豬的豬瘟抗體要100%合格。2005年，第二原種豬場(chǎng)季度抗體監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該場(chǎng)符合豬瘟凈化標(biāo)準(zhǔn)，決定以第二原種豬場(chǎng)為示范，開展豬瘟凈化工作，以抗體檢測(cè)為主，淘汰免疫耐受或免疫缺陷豬只，必要時(shí)輔以病原檢測(cè)方法；期望通過2～3年完成核心場(chǎng)的豬瘟清除/凈化。凈化技術(shù)方案見圖1。

圖1 抗體為主的豬瘟凈化技術(shù)方案

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 豬瘟疫苗的篩選(2006年) 為評(píng)估各廠家豬瘟疫苗是否存在質(zhì)量差異，特設(shè)此試驗(yàn)。選取第一種豬場(chǎng)斷奶健康保育豬100頭，隨機(jī)分成試驗(yàn)組與對(duì)照組，試驗(yàn)前未免疫豬瘟疫苗。對(duì)照組50 d免疫ZM豬瘟脾淋苗，試驗(yàn)組50 d免疫YS豬瘟脾淋苗，免疫劑量均為2頭份。分別于免疫后1個(gè)月和3個(gè)月，每組隨機(jī)采血18～30頭，評(píng)估豬瘟抗體。

1.5.2 母豬豬瘟抗體持續(xù)期試驗(yàn)(2006年) 為驗(yàn)證豬瘟疫苗能否維持一個(gè)繁殖周期，特在楊彭豬場(chǎng)和第一種豬場(chǎng)各固定一批母豬。在斷奶前3天，免疫4頭份的豬瘟疫苗(兔源組織苗)，分別在妊娠40～50 d、80～90 d和產(chǎn)后7～14 d(第一種豬場(chǎng)為斷奶前3天)采血，檢測(cè)豬瘟抗體。

1.5.3 產(chǎn)房仔豬超免試驗(yàn)(2006年) 產(chǎn)房仔豬是否超免，一直存在爭(zhēng)議，為此選擇4個(gè)獨(dú)立生長(zhǎng)育肥場(chǎng)開展超免與不超免的試驗(yàn)(A、B、C場(chǎng)和D場(chǎng)，前3個(gè)場(chǎng)常規(guī)免疫，D場(chǎng)超免)，免疫后分不同階段評(píng)估豬瘟抗體。D場(chǎng)出生當(dāng)天(0 d)接種2頭份疫苗，其后4個(gè)場(chǎng)均在30 d和60 d各免疫4頭份。A、B、C場(chǎng)和D場(chǎng)，每個(gè)豬場(chǎng)分別在一免前(4周)、二免前(7～8周)、 出保育(10周)、育肥12周、16～18周和20～22周隨機(jī)抽取健康豬只10頭，共240頭，采血評(píng)估豬瘟抗體。

1.5.4 生長(zhǎng)育肥豬免疫程序的制定(2006年) 生長(zhǎng)育肥豬一般免疫2次，為定制個(gè)性化的保育免疫方案，特開展相應(yīng)試驗(yàn)，即在常規(guī)30 d一免后，分別在50 d(對(duì)照組)和60 d(試驗(yàn)組)進(jìn)行二免；以試驗(yàn)組二免6周后，同時(shí)采血18～20頭健康豬只檢測(cè)豬瘟抗體，評(píng)估免疫效果。

1.5.5 核心母豬場(chǎng)的3次全群檢測(cè)(2005—2007年) 先對(duì)基礎(chǔ)豬場(chǎng)按比例采血檢測(cè)豬瘟抗體，若群體抗體符合凈化標(biāo)準(zhǔn)，則進(jìn)入3次全檢檢測(cè)階段。對(duì)于首次檢測(cè)不合格的豬只，再次免疫疫苗6周后檢測(cè)，若還不合格，則進(jìn)行淘汰處理。期間所有后備豬必須檢測(cè)豬瘟抗體，執(zhí)行合格準(zhǔn)入原則。

1.5.6 保育豬豬瘟免疫1次或2次的對(duì)比試驗(yàn)(2010年) 因核心場(chǎng)完成豬瘟凈化，為降低勞動(dòng)強(qiáng)度，特開展保育豬免疫1次(60 d，2頭份/次)和免疫2次(30 d和60 d，每次1頭份)的大群對(duì)比試驗(yàn)；分別于免疫后1個(gè)月和3個(gè)月隨機(jī)采血30頭豬檢測(cè)，比較二者的免疫效果。

1.5.7 保育豬只免1次豬瘟苗，定期監(jiān)測(cè)出欄育肥豬抗體(2010—2019年) 每個(gè)月10號(hào)定期抽檢各豬場(chǎng)快出欄育肥豬每欄2～3頭，共18～20頭，評(píng)估保育場(chǎng)豬瘟疫苗免疫效果，同時(shí)監(jiān)控每批豬瘟疫苗質(zhì)量。

1.5.8 異常豬只豬瘟的病原學(xué)檢測(cè)(2007—2019年) 對(duì)臨床上觀察到的異常表現(xiàn)，比如母豬流產(chǎn)，公豬精液異常，保育豬發(fā)病或死亡等，采集對(duì)應(yīng)樣品(血清、病料或精液等)，送去獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)豬瘟病毒。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的篩選 免疫后1個(gè)月和3個(gè)月的抗體檢測(cè)結(jié)果如表1。從表1可知，ZM苗優(yōu)于YS苗。

表1 保育豬不同豬瘟疫苗的對(duì)比試驗(yàn)

2.2 母豬豬瘟抗體持續(xù)期 見表2。由表2分析，隨著時(shí)間推移(從妊娠40～50 d到產(chǎn)后7～14 d)，抗體陽(yáng)性率整體上有所降低，但降幅緩慢；抗體阻斷率平均值和離散度隨時(shí)間的推移整體變化不大，母豬在整個(gè)妊娠階段豬瘟抗體衰減得很慢；產(chǎn)后7～14 d 豬瘟抗體阻斷率平均值有所下降，離散度比其他階段要大。按胎次分析，1～3胎母豬的豬瘟抗體比較理想，抗體陽(yáng)性率比其他胎次要高，接近100%，同時(shí)1～3胎的離散度相對(duì)較小，說明群體抗體水平的一致性好。說明斷奶前3天免疫一針，能夠保護(hù)母豬整個(gè)妊娠階段和分娩階段。

表2 楊彭豬場(chǎng)妊娠母豬各階段豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，第一種豬場(chǎng)從妊娠40～50 d到妊娠80～90 d，豬瘟抗體的陽(yáng)性率有所降低，但降幅比較緩慢；到斷奶前3天時(shí)，豬瘟抗體的陽(yáng)性率出現(xiàn)相對(duì)明顯的下降?？贵w阻斷率的平均值和離散度在整個(gè)妊娠階段差異不明顯，豬瘟抗體在妊娠階段衰減得比較慢；但斷奶前3天母豬群的抗體平均值出現(xiàn)較明顯下降，離散度也開始增大，表明母豬群在斷奶前表現(xiàn)出豬瘟抗體的衰減。按胎次分析，發(fā)現(xiàn)1～3胎妊娠母豬的豬瘟抗體比較理想，抗體陽(yáng)性率比其他胎次高，都在95%以上，同時(shí)離散度相對(duì)比較小，表明群體的抗體水平一致性好。

表3 第一種豬場(chǎng)妊娠母豬各階段豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果

通過上述2個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)，表明母豬在斷奶前3 d免疫4頭份的豬瘟組織苗，會(huì)產(chǎn)生有效的豬瘟抗體并能維持5個(gè)月，斷奶前免疫豬瘟疫苗是一種比較合理的免疫方法。

2.3 產(chǎn)房仔豬超免與否 通過4個(gè)豬場(chǎng)免疫試驗(yàn)，證實(shí)豬瘟疫苗常規(guī)免疫 (30 d～60 d) 整體效果優(yōu)于乳前免疫(0～60 d)[1]。

2.4 生長(zhǎng)育肥豬免疫程序優(yōu)化 2個(gè)保育豬場(chǎng)共6個(gè)批次豬瘟疫苗試驗(yàn)結(jié)果一致：30日齡首免豬瘟后，60日齡進(jìn)行二免的豬瘟抗體各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于50日齡[2]。

2.5 核心母豬場(chǎng)的3次全群檢測(cè) 2005—2007年的3次全群檢測(cè)結(jié)果如表4。每次全群檢測(cè)的數(shù)量約為1 500頭(含后備豬)。由表4可知，隨著豬瘟抗體不合格母豬的淘汰，以及持續(xù)不斷補(bǔ)充抗體合格后備豬，基礎(chǔ)豬群抗體陽(yáng)性率得到明顯提升，抗體平均值逐步上升，CV值變得越來(lái)越小，群體差異度越來(lái)越小，整個(gè)種豬群豬瘟抗體分布越來(lái)越理想。

表4 核心楊3次豬瘟全群檢測(cè)結(jié)果

2.6 保育豬豬瘟免疫1次或2次的對(duì)比 從2批豬的試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表5)分析，保育豬群免疫1次(試驗(yàn)組)的各項(xiàng)豬瘟抗體指標(biāo)均優(yōu)于2次免疫(對(duì)照組)。1次免疫不僅降低勞動(dòng)強(qiáng)度，同時(shí)提高免疫效果。從2011年2月開始，保育豬的豬瘟免疫更改為60日齡免疫1次，每次2頭份。

表5 試驗(yàn)組和對(duì)照組60日齡免疫豬瘟疫苗后1個(gè)月/3個(gè)月的豬瘟抗體結(jié)果

2.7 保育豬只免1次豬瘟疫苗后，快出欄育肥豬抗體的定期監(jiān)測(cè) 出欄前育肥豬監(jiān)測(cè)結(jié)果如表6。由表6分析，2011—2013年出欄前育肥豬的豬瘟抗體水平呈下降趨勢(shì)，2014—2015年豬瘟抗體有所上升，均在80%以上，相對(duì)比較理想。2013年豬瘟抗體平均陽(yáng)性率最低，僅82.8%，通過對(duì)疫苗追溯，發(fā)現(xiàn)抗體較差集中在2012年12月使用批號(hào)為130001-1的疫苗，2013年7月份調(diào)整疫苗，從11月份開始，豬瘟抗體明顯改善。近幾年育肥出欄前抗體陽(yáng)性率在91%以上。由此，豬瘟疫苗的常規(guī)評(píng)估可及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫苗問題。2019年因?yàn)橹苓叿侵挢i瘟疫情比較嚴(yán)峻，特殊時(shí)期為減少交叉污染，沒有開展每個(gè)月的采血監(jiān)督監(jiān)測(cè)。

表6 出欄前育肥豬豬瘟抗體陽(yáng)性率結(jié)果 (2011—2019年)

2.8 異常豬只豬瘟病原學(xué)檢測(cè) 良圻原種豬場(chǎng)2007—2019年異常豬只的豬瘟病原學(xué)檢測(cè)如表7。12年間共監(jiān)測(cè)豬瘟病毒1 337份(POSE)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明豬場(chǎng)從2007年以來(lái)沒有檢到豬瘟野毒。

表7 異常豬只豬瘟病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 (2007—2019年)

3 討論

3.1 豬瘟凈化方案的選擇 豬瘟凈化，傳統(tǒng)方法必須要逐頭采集扁桃體進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測(cè)，沒有檢測(cè)到豬瘟野毒才算是凈化。在豬場(chǎng)一線的執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師們以及與豬場(chǎng)接觸多的專家們認(rèn)為，扁桃體采樣對(duì)種豬應(yīng)激大，經(jīng)常存在采樣不準(zhǔn)的弊端。良圻原種豬場(chǎng)的豬瘟凈化方案(以抗體監(jiān)測(cè)為主，對(duì)全部基礎(chǔ)豬群連續(xù)多次監(jiān)測(cè)抗體，淘汰免疫缺陷或免疫耐受種豬，對(duì)產(chǎn)仔異常的母豬監(jiān)測(cè)豬瘟病原等)，在臨床上顯得方便實(shí)用，結(jié)果可靠，并有過凈化成功的案例[3-5]。2010年良圻原種豬場(chǎng)建立了大型規(guī)?；i場(chǎng)通過檢測(cè)淘汰長(zhǎng)期持續(xù)保持無(wú)豬瘟易感個(gè)體的清除豬瘟技術(shù)。

3.2 豬場(chǎng)豬瘟苗免疫程序的修正 豬瘟疫苗的免疫程序不是一成不變的，有時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況和疫苗特點(diǎn)通過科學(xué)合理的試驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。由于實(shí)踐中很難保證每頭剛出生的仔豬在吃初乳前接種豬瘟疫苗，同時(shí)仔豬的免疫器官也不完善，一般乳前免疫的抗體評(píng)估效果較差。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[1]，A、B、C三個(gè)不進(jìn)行超免的豬場(chǎng)，其保育豬在7～8周二免后，豬瘟抗體整體上很快升高，在22周時(shí)豬瘟抗體陽(yáng)性率分別為90%、100%和100%，而超免場(chǎng)(D場(chǎng))二免后豬瘟抗體不升反降；22周時(shí)，D場(chǎng)豬瘟抗體才有緩慢上升趨勢(shì)，抗體陽(yáng)性率僅有60%，遠(yuǎn)低于其他3個(gè)常規(guī)免疫場(chǎng)。保育豬30 d首免，60 d進(jìn)行第2次免疫優(yōu)于50 d進(jìn)行第2次免疫[2]。隨著種豬群豬瘟凈化工作的完成，由于群體內(nèi)沒有豬瘟野毒的存在，保育豬首次免疫可以推遲到母豬抗體基本消失之后，由此保育豬群的免疫次數(shù)由原來(lái)的2次減少至1次。

3.3 穩(wěn)定可靠的豬瘟疫苗是實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化的前提 通過近15年的豬瘟疫苗使用經(jīng)驗(yàn)，不同廠家和同一廠家不同批次的疫苗都會(huì)存在質(zhì)量差異，甚至某些廠家的細(xì)胞苗中還會(huì)檢出牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)[6]，因此對(duì)疫苗的篩選顯得十分重要。良圻原種豬場(chǎng)15年來(lái)，母豬場(chǎng)始終使用一個(gè)集團(tuán)公司的疫苗，期間出現(xiàn)過個(gè)別批次的疫苗質(zhì)量問題，只要有一個(gè)批次的豬瘟疫苗不穩(wěn)定，就會(huì)影響整個(gè)豬群的免疫抗體水平，豬瘟凈化成果就有前功盡棄的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要與廠家深度溝通，定制高品質(zhì)疫苗；同時(shí)實(shí)驗(yàn)室要做好每批疫苗在正式使用前的質(zhì)量監(jiān)測(cè)和臨床試驗(yàn)，通過質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后才能正式使用。

3.4 豬瘟E2疫苗的使用效果和應(yīng)用前景 豬瘟E2基因工程亞單位疫苗于2018年正式在國(guó)內(nèi)上市。王遵寶等用E2疫苗免疫豬瘟抗體陰性仔豬2次，二免2周后用石門毒系血毒攻毒(含106MLD)，免疫豬只全部存活，均無(wú)病變，均無(wú)排毒[7]。Tran等發(fā)現(xiàn)，越南科學(xué)家研發(fā)的E2亞單位疫苗(來(lái)自1.1基因型)可對(duì)3個(gè)不同基因型的流行毒株(1.1、2.1和2.2)提供全面的同源或者異源交叉保護(hù)[8]。Madera等發(fā)現(xiàn)E2亞單位疫苗一針免疫后2周提供全面保護(hù)，持續(xù)期4個(gè)月以上[9]。E2基因工程疫苗的推出為國(guó)內(nèi)豬瘟凈化提供了新思路，基因缺失疫苗配合鑒別診斷試劑，理論上規(guī)模化豬場(chǎng)凈化豬瘟將會(huì)更加便捷，這有待于國(guó)內(nèi)大型規(guī)?；N豬場(chǎng)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5 豬瘟凈化后對(duì)豬場(chǎng)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的影響 (2005—2015年) 豬場(chǎng)生豬死亡率明顯降低：良圻原種豬場(chǎng)哺乳仔豬死亡率比集團(tuán)公司5.38%低0.55百分點(diǎn)，保育豬死亡率比集團(tuán)公司7.81%低1.32百分點(diǎn)，育肥豬死亡率比集團(tuán)公司6.15%低1.58百分點(diǎn)；豬場(chǎng)獸藥費(fèi)單位重量開支明顯減少：良圻原種豬場(chǎng)基本豬群藥費(fèi)開支比集團(tuán)公司低0.66元/ kg。豬瘟凈化后也有利于豬繁殖與呼吸綜合征的防控：由于豬群內(nèi)沒有豬瘟和豬偽狂犬病等野毒，當(dāng)豬繁殖與呼吸綜合征不穩(wěn)定時(shí)，可以方便開展后備豬或發(fā)病母豬群的血清馴化，近10年來(lái)良圻原種豬場(chǎng)曾多次對(duì)母豬場(chǎng)開展血清馴化工作[10-12]，并取得了比較好的成績(jī)。

4 小結(jié)

從2005年開始，良圻原種豬場(chǎng)在核心種豬場(chǎng)系統(tǒng)地開展豬瘟逐步控制與凈化工作，以檢測(cè)豬瘟抗體為主，淘汰豬瘟免疫缺陷或耐受的種豬，后備豬豬瘟抗體保證100%合格準(zhǔn)入；2005—2007年在國(guó)內(nèi)首家連續(xù)3次在核心種豬場(chǎng)進(jìn)行全群檢測(cè)，且每次種豬群檢測(cè)數(shù)不低于1 400頭，綜合生物安全防疫措施，2007年完成核心場(chǎng)免疫狀態(tài)下的豬瘟凈化，為國(guó)內(nèi)規(guī)模種豬場(chǎng)開展豬瘟控制與凈化提供思路與借鑒。其凈化模式被國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制研究室認(rèn)可，作為豬瘟控制與凈化的備選方案，面向全國(guó)41家綜合試驗(yàn)站推廣應(yīng)用。

志謝：曾容愚博士提供E2疫苗的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)。