劉 娟 劉 壯 王 菲，3△

【提 要】 目的 應(yīng)用單變量分析聯(lián)合正交偏最小二乘判別分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)探索精神分裂癥患者與健康對照者的代謝譜差異。方法 收集118例精神分裂癥患者與123例健康對照者的血漿并進行非靶向代謝組學(xué)檢測，運用非參數(shù)檢驗聯(lián)合OPLS-DA模式識別方法篩選差異代謝物，然后進行通路分析探索紊亂的代謝通路。結(jié)果 基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測到669個代謝物，聯(lián)合非參數(shù)檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)與OPLS-DA方法篩選出52個差異代謝物(P<0.05，VIP>1.5)，主要涉及糖代謝、氨基酸代謝和脂代謝。通路分析結(jié)果顯示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路與三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)失調(diào)相關(guān)(FDR<0.05)。結(jié)論 應(yīng)用單變量分析聯(lián)合多元模式識別技術(shù)進行精神分裂癥的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析，能夠識別與疾病分子機制相關(guān)的差異代謝物，有助于了解疾病的本質(zhì)并為精神分裂癥的診斷、干預(yù)及治療提供依據(jù)。

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一種嚴(yán)重的精神障礙，全球患病率約1%，通常伴隨認(rèn)知、情感體驗、社交能力的損害，多發(fā)病于青壯年，病情反復(fù)，給患者、家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1-2]。精神分裂癥的病因復(fù)雜，目前主要的假說有神經(jīng)遞質(zhì)紊亂假說和神經(jīng)發(fā)育障礙假說，但其確切的分子機制迄今不明[3]。神經(jīng)細(xì)胞代謝的紊亂可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育和腦結(jié)構(gòu)的異常，即使是微小的代謝率改變也會影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、乙酰膽堿、Y- 氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,GABA)的釋放和合成[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者前額葉皮質(zhì)葡萄糖代謝率降低，這可能與其受損的認(rèn)知功能密切相關(guān)[6]。越來越多的證據(jù)提示，精神分裂癥的發(fā)病不僅僅是大腦結(jié)構(gòu)功能的改變，更可能是一種全身系統(tǒng)性疾病，因此從系統(tǒng)水平描述機體整體改變對理解復(fù)雜疾病的病理生理變化尤為重要[7-8]，同時也為精神障礙的診斷、預(yù)防和治療提供了新的思路。

近年來，隨著代謝組學(xué)逐漸應(yīng)用于精神疾病的研究，并發(fā)現(xiàn)精神分裂癥與廣泛的代謝紊亂密切相關(guān)，如能量代謝相關(guān)代謝通路、抗氧化系統(tǒng)相關(guān)代謝通路、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、氨基酸(如谷氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，組氨酸，?；撬幔彼?代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝[9-12]等。

精神疾病的代謝組學(xué)分析產(chǎn)生信息含量豐富的高維小樣本數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)的單變量分析方法無法從海量的代謝譜信息中發(fā)現(xiàn)代表組間差異的穩(wěn)定標(biāo)志物，這是目前代謝組學(xué)發(fā)展過程中所面臨的一個重要挑戰(zhàn)[13-15]。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)是一種新型的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法，其最大特點是可以去除自變量中與分類變量無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，模型變得簡單和易于解釋，判別效果更加明顯。利用OPLS-DA方法來分析代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，得到對分類有較大貢獻的差異性物質(zhì)，從而有助于挖掘疾病代謝模式變化的關(guān)鍵信息[16-18]。

本研究基于超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-MS)，獲取精神分裂癥患者與健康對照組血漿樣本的非靶向代謝譜信息，聯(lián)合單變量統(tǒng)計分析與多元模式識別方法鑒別患者組的差異代謝物，進而發(fā)現(xiàn)其紊亂的代謝通路，探索精神分裂癥代謝譜模式的變化，從系統(tǒng)水平對精神分裂癥患者的分子機制進行研究，以期為臨床診斷、干預(yù)和治療提供參考。

資料與方法

1.研究對象

患者組由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診收集的118例精神分裂癥患者組成。納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲以上患者符合精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第四版)(diagnostic and statistical manual of mental disorders-IV version，DSM-IV)軸I精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；18歲以下患者符合精神障礙調(diào)查篩查表及半定式診斷檢查(the schedule for affective disorders schizophrenia for school-age children-present and lifetime version,K-SADS-PL)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡11～55歲。健康對照組通過社會招募納入與患者組性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)相匹配的健康人，共123例。納入標(biāo)準(zhǔn)：無精神疾病障礙的診斷史及家族史；11～55歲。所有診斷會談均在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院精神醫(yī)學(xué)科完成，由2名經(jīng)培訓(xùn)的精神科專業(yè)人員獨立評估，使用簡明精神病評估量表(brief psychiatric rating scale，BPRS)評估精神癥狀的嚴(yán)重程度。

全部受試排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)神經(jīng)系統(tǒng)或其他精神疾病障礙診斷；(2)重大軀體疾病史；(3)藥物、酒精濫用或依賴史；(4)合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥；(5)懷孕或哺乳期婦女。

本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有受試者在入組前被詳細(xì)告知研究目的、方法和風(fēng)險，均自愿參加并簽署知情同意書。

2.非靶向代謝組學(xué)分析

采集所有參與者的外周血樣本，取肘靜脈血5ml于EDTA抗凝管中，血液樣本于2000g離心10min，分離出血漿樣品置于-80℃冰箱保存。在代謝組學(xué)分析前先進行樣品預(yù)處理，將血漿樣本取出，于4℃解凍，加入代謝組提取液以沉淀蛋白，渦旋，離心，復(fù)溶后干燥保存，直至檢測。血漿代謝組學(xué)信息在Ultimate 3000超高效液相色譜與Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(UHPLC-HRMS)(Thermo Scientific，San Jose，USA)串聯(lián)儀器上采集。實驗測定過程中加入質(zhì)量控制(QC)樣本的測定，每30個樣本加入一個QC樣本，以確定樣品數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。數(shù)據(jù)預(yù)處理通過Compund Discoverer version 2.1和TraceFinder software version 4.1(Thermo Scientific，USA)軟件完成，包括峰對齊、峰檢測參數(shù)設(shè)定、峰面積提取和數(shù)據(jù)歸一化。統(tǒng)計分析通過SPSS 25.0和SIMCA-P 14.1完成。

3.統(tǒng)計分析與生信分析

采用單變量與多元模式識別技術(shù)結(jié)合的方法篩選差異代謝物，其中單變量分析根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況選擇獨立樣本t檢驗或者非參數(shù)檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)，采用FDR方法進行校正，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；多元模式識別技術(shù)采用正交偏最小二乘判別分析區(qū)分組間代謝譜差異，通過

OPLS-DA建模獲得變量重要性評分(variable importance in projection，VIP)評價模型中變量對類別區(qū)分的貢獻程度。以P<0.05且VIP>1.5的變量作為差異代謝物，并通過MetaboAnalyst 4.0(http：//www.metaboanalyst.ca/)在線平臺對差異代謝物進行通路分析，通路分析FDR<0.05被識別為顯著改變的代謝通路。

結(jié) 果

1.所有研究對象的基本特征

兩組受試對象在性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，在簡明精神病評定量表得分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 受試對象的人口學(xué)資料

2.篩選差異代謝物

經(jīng)過UHPLC-MS分析，共獲得669個代謝物，其中正離子模式(ESI+)下檢測到473個，負(fù)離子模式(ESI-)下檢測到196個。在QC和內(nèi)標(biāo)物校準(zhǔn)代謝物的響應(yīng)后，90.8%的代謝物在正模式下相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<20%，95.4%的代謝物在負(fù)離子模式下的RSD<20%，表明本次非靶向代謝組學(xué)分析表現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。

如圖1所示，數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，故聯(lián)合非參數(shù)檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)與OPLS-DA方法進行差異代謝物的篩選，發(fā)現(xiàn)52個代謝物(P<0.05，VIP>1.5)在患者組中改變，包括糖代謝的中間代謝產(chǎn)物的水平降低，如葡萄糖/果糖，甘油酸，檸檬酸/異檸檬酸，延胡索酸和蘋果酸；氨基酸代謝的中間代謝產(chǎn)物的水平降低，如?；谋奖彼?，亮氨酸，異亮氨酸，色氨酸，天冬酰胺；不飽和脂肪酸代謝相關(guān)的代謝物的升高，如棕櫚油酸和油酸；甾體代謝物水平的降低以及磷脂代謝物的改變。

圖1 精神分裂癥患者組與健康對照組之間差異代謝物的類別

3.生信分析

如圖2所示，進一步的通路分析結(jié)果顯示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路與三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)失調(diào)相關(guān)(FDR<0.05)。

圖2 通路分析結(jié)果

討 論

本研究對精神分裂癥患者與健康對照者進行血漿代謝譜信息采集，采用單變量分析聯(lián)合多元模式識別方法進行差異代謝物的篩選，發(fā)現(xiàn)患者組存在廣泛的糖代謝和氨基酸代謝相關(guān)代謝物水平的降低，不飽和脂肪酸水平的升高，甾體代謝物的降低，以及膜磷脂代謝的紊亂。患者組上述改變的代謝譜是圍繞以三羧酸循環(huán)為核心的能量代謝紊亂展開的。

在本研究中，患者組TCA循環(huán)中的檸檬酸/異檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸和蘋果酸明顯低于健康對照組(圖3)，表明精神分裂癥患者存在TCA循環(huán)代謝率的降低。先前的研究發(fā)現(xiàn)支持這一結(jié)果，Liu和Cai等人發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者存在延胡索酸和檸檬酸水平的改變[19-20]；Bubber等人針對首次發(fā)作精神分裂癥患者的尸檢研究發(fā)現(xiàn)其大腦中TCA循環(huán)的一系列酶水平顯著改變[21]。綜上所述，TCA循環(huán)的改變可能對機體與大腦代謝產(chǎn)生深刻的影響并導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)病。

近年來，關(guān)于精神分裂癥的發(fā)病機制，有研究提出線粒體功能與能量代謝障礙假說[22-23]。能量代謝不僅包含糖代謝，還涉及到大部分脂類與氨基酸的合成與氧化分解。根據(jù)本研究結(jié)果，精神分裂癥患者表現(xiàn)出葡萄糖/果糖和氨基酸代謝的代謝物水平降低，這與之前的研究發(fā)現(xiàn)一致[24-25]。葡萄糖是能量的主要來源，先前的多個研究均發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者尸檢腦組織、腦脊液和外周血中糖代謝相關(guān)的代謝物及酶水平等顯著降低，提示糖代謝的降低與精神分裂癥的認(rèn)知功能、語言交流等癥狀密切相關(guān)[26-29]。其中，色氨酸與神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的合成與代謝有關(guān)，而GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，這些氨基酸的降低表明精神分裂癥存在神經(jīng)遞質(zhì)代謝的紊亂[30]。此前已有研究報道，精神分裂癥患者的脂代謝如磷脂，甾體代謝物等改變[31]，提示神經(jīng)細(xì)胞膜及神經(jīng)元活動相關(guān)脂質(zhì)的異常參與精神分裂癥的分子機制。不飽和脂肪酸如棕櫚油酸和油酸的神經(jīng)保護作用已有報道，Yang等人基于代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者提示上調(diào)的脂肪酸分解代謝可能是由于代償下降的糖代謝水平，彌補能量供應(yīng)的不足[25]。結(jié)合以上發(fā)現(xiàn)，能量代謝的紊亂可能進一步導(dǎo)致廣泛的糖、脂、氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)代謝的改變，與精神分裂癥的發(fā)病密切相關(guān)。

綜上所述，在精神分裂癥的代謝組學(xué)研究中，基于多元統(tǒng)計模式識別方法對信息量巨大的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行分析，有利于挖掘與疾病病理生理機制相關(guān)的代謝特征。本研究利用單變量分析聯(lián)合多元模式識別方法篩選差異代謝物，進一步發(fā)現(xiàn)了以TCA循環(huán)為核心的能量代謝障礙在精神分裂癥發(fā)病中的重要作用。未來針對能量代謝相關(guān)分子改變的研究將有助于了解精神分裂癥的本質(zhì)，成為研究其發(fā)病機制的突破口。