陳慧霞，閆宇涵，于慧，王占黎，胡海

高血壓是心腦血管疾病的常見危險(xiǎn)因素，可誘發(fā)卒中、心力衰竭、心肌梗死和腎功能衰竭等［1］。腎性高血壓是繼發(fā)性高血壓的一種，主要由腎動(dòng)脈病變及腎臟實(shí)質(zhì)性病變導(dǎo)致，病理改變包括結(jié)締組織或間質(zhì)組織增生、腎小球玻璃樣變性、腎小管萎縮及腎細(xì)小動(dòng)脈狹窄等，且易造成腎臟供血不足［2］。該病受遺傳、生活方式和環(huán)境因素等影響，但其潛在的分子機(jī)制尚未充分闡明［3］。代謝組學(xué)通過定量檢測體內(nèi)小分子化合物水平，研究人體內(nèi)基礎(chǔ)代謝變化，為探索代謝性疾病的病因提供可靠依據(jù)［4］。目前對(duì)腎性高血壓的代謝組學(xué)研究十分有限，本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-TOF/MS）技術(shù)，探討兩腎一夾（2K1C）腎性高血壓大鼠血清代謝物的變化趨勢(shì)及其相關(guān)代謝通路，為腎性高血壓的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 清潔級(jí)4周齡SD大鼠20只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK-（京）2016-0006。全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（BP-300A，成都泰盟）；安捷倫7890氣相色譜儀（Agilent），飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LECO）；離心機(jī)、超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific）、分析天平（Sartorius）、研磨儀（上海凈信科技有限公司），超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司），烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），真空干燥儀（太倉市華美生化儀器廠）。甲醇（CNW Technologies），氯仿、吡啶（Adamas），甲氧銨鹽（TCI），核糖醇（SIGMA），BSTFA（REGIS Technologies），飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 2K1C腎性高血壓大鼠模型的建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后尾套法測定大鼠尾動(dòng)脈收縮壓和體質(zhì)量基線值。根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)（Sham）組和2K1C組，每組10只。大鼠以仰臥位四肢固定于手術(shù)臺(tái)，剪去腹部毛發(fā)，碘伏消毒后沿正中腹白線切開腹部肌肉層約2 cm，棉簽輕輕分離雙側(cè)皮下淺筋膜及肌肉，暴露左腎，鈍性分離左腎動(dòng)脈［5-6］。2K1C模型組在左腎動(dòng)脈中段套內(nèi)徑0.2 mm的銀夾，Sham組分離左側(cè)腎動(dòng)脈但不鉗夾。動(dòng)態(tài)觀察大鼠生命體征36 h，術(shù)后3 d給予青霉素V鉀片0.5萬U/d［7］。術(shù)前及術(shù)后1～4周用尾套法測定尾動(dòng)脈收縮壓，稱量大鼠體質(zhì)量。術(shù)后4周末大鼠尾動(dòng)脈收縮壓較術(shù)前基線值上升30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）視為模型建立成功。

1.3 樣本前處理及GC-TOF/MS檢測 在術(shù)后4周末處死大鼠，收集其血清樣本，放于液氮中速凍2 h后放置-80℃冰箱直到后續(xù)分析，每組選擇3只進(jìn)行代謝組學(xué)分析。取血清樣本50μL于1.5 mL EP管中，加入200μL預(yù)冷甲醇和5μL核糖醇，渦旋30 s后冰浴超聲10 min；將樣本4℃、10 000 r/min離心15 min，移取180μL上清液于1.5 mL EP管中，每個(gè)樣本取30μL混合成質(zhì)控（QC）樣本。樣本在真空濃縮器中干燥提取物，加入30μL甲氧胺鹽試劑，混勻后放入烘箱中80℃烘干30 min；向每個(gè)樣品中加入40μL BSTFA（含1%TMCS，V/V），將混合物70℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5μL FAMEs（溶于氯仿）。檢測系統(tǒng)采用DB-5MS毛細(xì)管柱，以無分流模式注入1μL樣品。使用氦氣作為流動(dòng)相，前部入口吹掃流量為3 mL/min，通過色譜柱的氣體流速為1 mL/min。初始溫度50℃1 min，然后以20℃/min的速率升至310℃，然后在310℃下保持6 min。注入、傳輸線和離子源溫度分別為280、280和250℃，電子碰撞模式下，能量為-70 eV。在溶劑延遲4.8 min后，以每秒掃描12.5張質(zhì)譜圖的速率在m/z范圍50～500的全掃描模式下獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Chroma-TOF（v4.3x，LECO）軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括峰提取、基線校正、反褶積、校正和積分，并利用LECO-Fiehn-Rtx5數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜和保留指數(shù)進(jìn)行匹配，進(jìn)行代謝物鑒定。

1.5 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）組間模式識(shí)別采用OPLS-DA。使用SIMCA軟件（V16.0.2）對(duì)每個(gè)樣本鑒定到的代謝物的相對(duì)含量值數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)（Log）轉(zhuǎn)換加UV格式化（Unit Variance Scaling）處理，根據(jù)結(jié)果構(gòu)建相應(yīng)的OPLS-DA得分圖。

1.6 差異代謝物的篩選 根據(jù)OPLS-DA模型的第一主成分變量重要性（VIP）值，結(jié)合2組代謝物相對(duì)定量比較的P值，以VIP值＞1且P＜0.05為條件進(jìn)行篩選。

1.7 差異表達(dá)代謝物的層次聚類分析 通過分析得到的差異表達(dá)代謝物，在生物學(xué)上往往具有結(jié)果和功能相似性或互補(bǔ)性，或者受同一代謝通路的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，表現(xiàn)為在不同實(shí)驗(yàn)組間具有相似或相反的表達(dá)特征。對(duì)此類特征進(jìn)行層次聚類分析，有助于將具有相同特征的代謝物歸為一類，并發(fā)現(xiàn)代謝物在實(shí)驗(yàn)組間的變化特征。計(jì)算差異表達(dá)代謝物定量值的歐式距離矩陣（Euclidean distance matrix），以完全連鎖方法對(duì)差異表達(dá)代謝物進(jìn)行聚類，并以熱圖進(jìn)行展示。

1.8 差異表達(dá)代謝物的代謝通路分析 使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫搜索差異表達(dá)代謝物的相關(guān)代謝通路。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同組術(shù)后4周和建模前比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2K1C高血壓大鼠模型建立 術(shù)后4周，2K1C組大鼠左側(cè)腎臟體積明顯縮小、形態(tài)萎縮，見圖1。術(shù)后4周2K1C組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓較建模前明顯升高（t=9.990，P＜0.05），且上升＞30 mmHg，7只2K1C高血壓大鼠模型建立成功。建模前及術(shù)后4周2組大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 OPLS-DA結(jié)果 2K1C組與Sham組OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖分析結(jié)果顯示，2組樣本區(qū)分明顯，見圖2。

Fig.1 Comparison of kidney between 2K1C group and sham group圖1 2K1C組大鼠腎臟對(duì)比圖

Tab.1 Results of systolic blood pressure and body weight of rats in the two groups表1 2組大鼠建模前及術(shù)后4周尾動(dòng)脈收縮壓、體質(zhì)量變化（±s）

Tab.1 Results of systolic blood pressure and body weight of rats in the two groups表1 2組大鼠建模前及術(shù)后4周尾動(dòng)脈收縮壓、體質(zhì)量變化（±s）

＊＊P＜0.01；術(shù)后2周2K1C組3只大鼠出現(xiàn)消瘦、癱瘓、最終死亡，予以剔除

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Fig.2 Scatter plot of OPLS-DA model scores in the sham group and 2K1C group圖2 2K1C組對(duì)Sham組的OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖

2.3 差異表達(dá)代謝物的篩選 質(zhì)譜數(shù)據(jù)定性后，共得到31種差異表達(dá)代謝物。與Sham組相比，2K1C組中有21種上調(diào)，10種下調(diào)。依據(jù)代謝物與質(zhì)譜檢測峰的匹配度（similarity）打分及其count值，將部分代謝物進(jìn)行刪減和合并，最終2K1C模型組有14種差異表達(dá)代謝物，其中3種下調(diào)，11種上調(diào)，見圖3，表2。

2.4 差異表達(dá)代謝物的聚類分析 酪氨酸、膽酸、豆甾醇3種代謝物經(jīng)過聚類分析歸為一類，在2K1C組低表達(dá)；胞苷-磷酸、乳酰胺、花生四烯酸、富馬酸、雙縮脲、馬尿酸、木糖、七烷酸、2-羥基-3-異丙基丁二酸、吲哚乳酸酯、順-巨頭鯨魚酸11種代謝物經(jīng)過聚類分析歸為一類，在2K1C組高表達(dá)。見圖4。

Fig.3 Differential expression metabolites screening volcano plot圖3 差異表達(dá)代謝物篩選火山圖

Tab.2 Fourteen differentially expressed metabolites in 2K1C model group表2 2K1C組14種差異表達(dá)代謝物

Fig.4 Heatmap of hierarchical clustering analysis for differentially expressed metabolites in 2K1C group and sham group圖4 2K1C組與Sham組差異表達(dá)代謝物的層次聚類分析熱力圖

2.5 差異表達(dá)代謝物的KEGG通路分析 在取得差異表達(dá)代謝物的匹配信息后，利用KEGG通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索和代謝通路分析。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)代謝物共涉及檸檬酸鹽（TCA）循環(huán)，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，花生四烯酸代謝，嘧啶代謝，酪氨酸代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，初級(jí)膽汁酸生物合成等通路，具體結(jié)果以氣泡圖展示，見圖5。

Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway analysis of differentially expressed metabolites圖5 差異表達(dá)代謝物的KEGG通路分析氣泡圖

3 討論

本研究通過建立2K1C腎性高血壓大鼠模型，采用GC-TOF/MS代謝組學(xué)方法，系統(tǒng)研究2K1C腎性高血壓大鼠潛在生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)及代謝通路，同時(shí)通過增設(shè)Sham組排除損傷對(duì)大鼠的影響，進(jìn)而通過對(duì)2K1C腎性高血壓大鼠血清進(jìn)行檢測。與Sham組比較，2K1C組血清中有14種差異表達(dá)代謝物水平出現(xiàn)明顯變化，其中11種呈上升趨勢(shì)，3種呈下降趨勢(shì)。上述差異表達(dá)代謝物參與了體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成等生物途徑。

富馬酸是一種有機(jī)酸，是TCA循環(huán)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物［8］，而TCA循環(huán)是調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞代謝的核心［9］。富馬酸二乙酯可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為富馬酸。Tian等［10］發(fā)現(xiàn)以1 mmol/（kg·d）靜脈注射富馬酸二乙酯可明顯加重高鹽誘導(dǎo)的大鼠高血壓。此外，van Deventer等［11］運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)測定非洲男性高血壓患者與健康人的尿液代謝圖譜，發(fā)現(xiàn)高血壓患者富馬酸水平明顯升高。另有研究通過GCTOF/MS法分析年輕高血壓患者和健康對(duì)照者的血漿樣本后發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血漿富馬酸含量增加［12］。本實(shí)驗(yàn)中2K1C組富馬酸含量明顯上調(diào)，與上述研究結(jié)果相一致。胞苷-磷酸水平與氨基酰-tRNA生物合成和嘧啶代謝有關(guān)［13］。在本研究中，2K1C腎性高血壓大鼠血清中胞苷-磷酸水平顯著增加，提示胞苷-磷酸參與的能量代謝發(fā)生紊亂。馬尿酸由腸道微生物將飲食中的芳香族化合物轉(zhuǎn)化而來，馬尿酸的排泄量與腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收減少有關(guān)［14］。本研究觀察到2K1C腎性高血壓大鼠血清馬尿酸含量升高，這可能是由于2K1C腎性高血壓大鼠腎臟損傷導(dǎo)致馬尿酸代謝減弱。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，2K1C腎性高血壓大鼠血清木糖含量升高，與Hao等［15］發(fā)現(xiàn)木糖水平越高，高血壓風(fēng)險(xiǎn)越高的結(jié)果一致。

氨基酸代謝與機(jī)體血壓的變化密切相關(guān)。酪氨酸作為去甲腎上腺素的前體可促使大腦中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，從而降低心血管交感神經(jīng)張力［16］。也有研究顯示，較高的酪氨酸攝入量（0.3%的蛋白質(zhì)）有助于降低血壓［17］。Lu等［18］采用GC-TOF/MS檢測自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的血漿代謝譜變化，分析發(fā)現(xiàn)SHR酪氨酸代謝物含量降低。本研究中，與Sham組相比，2K1C腎性高血壓大鼠血清中酪氨酸含量明顯下降，提示大鼠體內(nèi)氨基酸代謝異常，進(jìn)而升高心血管交感神經(jīng)張力，促使血壓上升。

脂質(zhì)代謝變化是高血壓的潛在發(fā)病機(jī)制，在血脂異常與高血壓患者中，都可發(fā)現(xiàn)血管功能異常［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，2K1C組血清花生四烯酸含量明顯升高?；ㄉ南┧峥赏ㄟ^環(huán)氧合酶途徑產(chǎn)生血栓素A2（TXA2），能夠促進(jìn)血小板聚集和血管收縮［20］。在高血壓發(fā)生的病理過程中，由于血管內(nèi)皮受損，內(nèi)皮下層膠原纖維暴露，與血小板結(jié)合，激活并釋放TXA2［21］。

膽酸是初級(jí)膽汁酸生物合成的代謝物，抑制血管系統(tǒng)中11β-羥基類固醇脫氫酶基因（11β-HSD2）和醛固酮合成酶基因（CYP11B2）的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血管中醛固酮含量降低，皮質(zhì)酮生成增加，血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)。本研究中，2K1C組血清中膽酸含量下降，提示可能在腸道中膽酸吸收增加。

綜上所述，與Sham組比較，2K1C腎性高血壓大鼠血清中有多種代謝物水平出現(xiàn)明顯變化，這些差異表達(dá)代謝物參與了體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成等生物途徑，進(jìn)而造成代謝紊亂。