朱必康，舒克鋼，徐偉華，瞿洋洋，龐聰，羅世興△

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性的關(guān)節(jié)退行性疾病，常與年齡或創(chuàng)傷相關(guān)［1］。OA常以關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬和活動受限為主要臨床表現(xiàn)，其病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨下骨改變和周圍軟組織炎癥等［2-4］。蘆薈多糖（aloe polysaccharide，APS）是從蘆薈中提純的，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖或其衍生物組成的一類具有生物活性的大分子化合物［5-6］。許多研究報道了APS具有促進細胞增殖［7］、護肝［8］、皮膚修復(fù)［5-6,9］、抗菌、抗炎［10-12］、免疫調(diào)節(jié)［13-14］和抗氧化［6,15-17］等作用。另有研究顯示APS抗炎作用顯著，對皮膚創(chuàng)面的修復(fù)和細胞外基質(zhì)重構(gòu)所需的糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原（COL2A1）等的分泌有促進作用［6］。因此，APS或可作為關(guān)節(jié)軟骨保護劑用于OA的治療。本研究旨在通過體外和體內(nèi)實驗，探究APS對OA的抗炎作用和軟骨穩(wěn)態(tài)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級的3日齡雄性SD乳鼠5只，8周齡180～200 g雄性SD大鼠18只，均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要儀器與試劑 超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、全波長酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；LightCycler?96實時熒光定量PCR（qPCR）儀（Roche公司）。APS（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自邁新公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、1%（V/V）青-鏈霉素、10 cm培養(yǎng)皿、12孔和24孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、番紅O染色試劑盒（北京索萊寶有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibeo公司）；CCK-8（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司）；總RNA提取試劑盒（Magen公司）。白細胞介素（IL）-1β（Bioss公司）；Hoechst 33258（Molecular Probes，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（Takara中國）］；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、蛋白聚糖（ACAN）、COL2A1、GAPDH引物（武漢金開瑞生物工程有限公司）；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；MMP-13一抗（Proteintech公司），通用型SP-9000試劑盒（小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)，北京中杉金橋生物有限公司），DAPI染液（ThermoFisher），F(xiàn)ITC熒光二抗（武漢Boster生物工程有限公司）；1,9-二甲基亞甲藍（DMMB，北京百靈威科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 關(guān)節(jié)軟骨細胞的提取與培養(yǎng) 取3日齡SD乳鼠5只，2%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，于75%乙醇中浸泡消毒10 min，在超凈臺上使用無菌器械取下兩側(cè)膝關(guān)節(jié)，用眼科剪分離出關(guān)節(jié)軟骨，用含1%青-鏈霉素的生理鹽水洗滌2～3次，充分剪碎并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，0.25%胰蛋白酶作用30 min，充分去除軟骨周圍組織，1 000 r/min離心1 min并棄上清液，隨后在生理鹽水中清洗3次，加入2 g/L的無血清的Ⅱ型膠原酶在37℃下二次消化3～4 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清取沉淀收集軟骨細胞并重懸，接種于含有1%青-鏈霉素和10%（V/V）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在鏡下觀察到細胞完全貼壁后，換液去除懸浮細胞，之后每2 d換液1次，細胞融合達到85%～90%后，用1 mL的0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，使用5 mL含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基終止消化，按照1傳3的比例傳代。取第2代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞增殖能力測定 使用CCK-8法測量APS對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的影響，將第2代關(guān)節(jié)軟骨細胞消化、計數(shù)后重懸稀釋為1×104個/mL，加入200μL/孔的細胞懸液（細胞密度2 000個/孔）接種在96孔板上，12 h后更換含不同劑量（0、5、10、20、40和80 g/L）APS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10μL的CCK-8增強型溶液，輕輕搖晃敲擊培養(yǎng)板促進混勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，避光，酶標儀檢測各孔450 nm處的光密度（OD）值。

1.3.3 實驗分組 實驗分為空白組，模型組和低、中、高劑量組。空白組不加任何試劑，模型組和各劑量組加入10μg/L IL-1β，各劑量組根據(jù)細胞毒性測定結(jié)果分別加入低、中、高劑量的APS。將關(guān)節(jié)軟骨細胞分別接種到有爬片/無爬片的6孔板和24孔板中，待24 h細胞貼壁后換成各組對應(yīng)的培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔，干預(yù)24 h后進行相應(yīng)檢測。

1.3.4 軟骨細胞DNA含量和GAG分泌量的檢測 將細胞按2×105個/孔的密度接種在6孔板上，培養(yǎng)12 h后細胞貼壁，分別給予5組細胞相應(yīng)的處理24 h后，各組細胞用PBS沖洗、1 000 r/min離心1 min后收集于1.5 mL EP管中。加入1 mL PBS和2.5μL蛋白酶K溶液，56℃水浴8 h。將上述溶液離心后取上清900μL，并加入1μL Hoechst 33258避光孵育20 min，各組按200μL/孔加入96孔板中，使用熒光酶標儀檢測激發(fā)波長為460 nm處OD值。最后基于小牛胸腺的DNA標準曲線來計算樣本中DNA含量。取上述剩余溶液100μL樣品，并加入900μL現(xiàn)配的DMMB溶液，充分混合均勻后，按200μL/孔轉(zhuǎn)移至96孔板中，在熒光酶標儀上檢測525 nm處的OD值，基于硫酸軟骨素的標準曲線得出樣本組中GAG分泌量。

1.3.5 qPCR檢測OA相關(guān)基因的表達水平 使用總RNA提取試劑盒提取各組樣本的總RNA，并檢測OD260/OD280比值。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBE Green熒光染料法，在qPCR儀上進行反應(yīng)：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，72℃延伸5 min，共40個循環(huán)。每組樣品重復(fù)3次，并以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法得出各目的基因相對表達量。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences of OA related genes表1 OA相關(guān)基因引物序列

1.3.6 ELISA法檢測IL-6和TNF-α水平 收集各組細胞的上清液，ELISA法檢測其中的炎性因子IL-6、TNF-α水平，具體操作按各試劑盒說明書進行。

1.3.7 HE染色和番紅O染色 將各組細胞爬片PBS輕洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，3 min/次；分別按HE染色試劑盒和番紅O染色試劑盒說明書染色后封片，于倒置顯微鏡下（×100）觀察拍照。

1.3.8 細胞免疫熒光染色 將空白組、模型組和20 g/L的APS實驗組細胞爬片用PBS輕洗2～3次，3 min/次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，3 min/次；按免疫熒光染色說明書染色封片，于倒置熒光顯微鏡下（×100）觀察存圖，并根據(jù)Image J軟件進行細胞MMP-13表達情況的定量分析。

1.3.9 動物實驗 18只雄性SD大鼠采用完全隨機分組法分為3組，每組6只，分別為假手術(shù)組、OA組和實驗組。OA組和實驗組行內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)（DMM）手術(shù)，用2.5%異氟醚麻醉大鼠，切斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨副韌帶誘導(dǎo)OA模型［18］。假手術(shù)組只暴露內(nèi)側(cè)半月板脛骨副韌帶，不切除。DMM術(shù)后第1天，實驗組以25 mg/kg的劑量向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射APS，每周注射1次，共8周，OA組和假手術(shù)組分別注射等量生理鹽水。最后一次給藥后處死所有大鼠，取膝關(guān)節(jié)標本，脫鈣完成后脫水、包埋和切片。按試劑盒說明書的操作流程進行HE染色和番紅O固綠染色，使用國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（OARSI）的骨關(guān)節(jié)炎評分標準對番紅O固綠染色結(jié)果進行評分，評估關(guān)節(jié)軟骨損傷程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph pad prism 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey's法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對IL-1β誘導(dǎo)的炎性軟骨細胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，APS的劑量大于40 g/L時對SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞有明顯的毒性（F=24.310，P＜0.05），見圖1。因而后續(xù)實驗選擇5、10和20 g/L的APS作為低、中、高劑量組。

Fig.1 The effects of ASP on normal chondrocytes of SD rats detected by CCK-8圖1 CCK-8檢測APS對SD大鼠正常軟骨細胞活性的影響

2.2 APS對軟骨細胞DNA含量和GAG分泌的影響 模型組DNA含量較空白組降低，低、中、高劑量組均較模型組升高（P＜0.05）。模型組GAG分泌量較空白組降低，高劑量組GAG分泌量高于模型組（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Comparison of DNA content and GAG secretion of chondrocytes between the five groups圖2 各組軟骨細胞DNA含量和GAG分泌量比較

2.3 qPCR檢測APS對炎性軟骨細胞中OA相關(guān)基因表達的影響 模型組與空白組相比，軟骨特異性基因（ACAN和COL2A1）、炎癥基因（TNF-α和IL-6）和MMP基因（MMP-3和MMP-13）的相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，表明體外炎癥模型造模成功。高劑量組的ACAN和COL2A1的相對表達量均高于模型組，而TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-13的相對表達量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the expression levels of OA related genes in chondrocytes between the five groups表2 各組軟骨細胞中OA相關(guān)基因的表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of OA related genes in chondrocytes between the five groups表2 各組軟骨細胞中OA相關(guān)基因的表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，P＜0.05

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2.4 ELISA檢測APS對軟骨細胞分泌炎性因子的影響 模型組TNF-α和IL-6的分泌量高于空白組，低、中、高劑量組低于模型組（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Levels of inflammatory cytokines secreted by chondrocytes in each group detected by ELISA圖3 ELISA檢測各組軟骨細胞分泌炎性因子的水平

2.5 細胞染色觀察APS對軟骨細胞的影響 HE染色結(jié)果顯示，各劑量組與空白組中軟骨細胞呈現(xiàn)舒展狀態(tài)，細胞形態(tài)良好；而模型組中部分軟骨細胞已凋亡裂解，數(shù)量較少，且可見因炎癥損傷造成的軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)扁平瘦弱的觸角表現(xiàn)。番紅O染色結(jié)果顯示，空白組中呈現(xiàn)強著色，經(jīng)IL-1β處理的模型組的軟骨細胞分泌軟骨基質(zhì)減少，導(dǎo)致著色弱；而各劑量APS干預(yù)組均顯示出較強的陽性染色，且高劑量組陽性程度較為接近空白組，見圖4。

2.6 細胞免疫熒光染色 與空白組（0.33±0.08）比較，模型組軟骨細胞MMP-13蛋白表達（18.85±2.27）增多，高劑量組（10.65±1.88）較模型組明顯降低（F=89.300，P＜0.01），見圖5。

2.7 膝關(guān)節(jié)組織HE染色 與假手術(shù)組相比，OA組軟骨層顯示出典型的骨關(guān)節(jié)炎形態(tài)變化，呈現(xiàn)出裂隙和纖維樣磨損以及軟骨基質(zhì)的損失，軟骨細胞形態(tài)呈現(xiàn)成纖維樣和細胞排列不規(guī)整。與OA組相比，實驗組軟骨細胞形態(tài)和軟骨基質(zhì)損失改善，見圖6。

2.8 各組膝關(guān)節(jié)組織番紅O固綠染色以及軟骨損傷評分的比較 OA組軟骨層中的GAG呈現(xiàn)弱染（紅色），軟骨基質(zhì)降解嚴重，而在APS治療后呈現(xiàn)出較強的陽性染色，見圖6。OARSI評分結(jié)果顯示，假手術(shù)組（1.33±0.58）與實驗組（3.67±1.53）均低于OA組（9.33±1.53），差 異有 統(tǒng) 計學(xué) 意 義（F=30.470，P＜0.05）。

Fig.4 Chondrocytes in each group observed by cell staining(×100)圖4 細胞染色光鏡觀察各組軟骨細胞（×100）

Fig.5 Immunofluorescence analysis of APS regulating MMP-13 expression in chondrocytes(amplification factor,×100)圖5 免疫熒光分析APS對軟骨細胞MMP-13表達的調(diào)控（免疫熒光，×100）

3 討論

傳統(tǒng)的OA治療方法包括改變生活方式、口服或注射藥物、物理療法和外科手術(shù)。臨床上藥物治療常用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射類固醇、透明質(zhì)酸，同時口服非甾體抗炎藥和對乙酰氨基酚通常也是OA的一線療法［4，19］。但是，上述藥物的作用旨在潤滑關(guān)節(jié)腔、緩解疼痛和抗炎，長期治療對軟骨退行性病變效果并不明顯。軟骨基質(zhì)的合成與降解的平衡是維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［2］。理想的藥物治療應(yīng)是能夠抑制軟骨基質(zhì)降解、促進軟骨細胞外基質(zhì)的分泌和保護軟骨細胞免受炎癥損傷，即通過減少炎癥損傷和增加軟骨修復(fù)從而逆轉(zhuǎn)OA的進程［19］。因此，研發(fā)具有保護和激活軟骨細胞的抗炎特性的OA治療藥物具有重要的臨床意義。本研究是基于從天然生物蘆薈中提取的、具有生物活性的APS，通過體內(nèi)外實驗證明其對SD大鼠骨關(guān)節(jié)炎有積極的治療作用。

Fig.6 HE staining and Saffron O fast green staining and OARSI score of knee tissues(×40)圖6 膝關(guān)節(jié)組織染色及其OARSI評分（×40）

本研究通過CCK-8法篩選出有利于細胞增殖的低、中和高APS劑量后，建立體外IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞炎癥模型，通過檢測GAG分泌量、炎性因子和基質(zhì)降解酶的表達水平來探索APS潛在的抗炎和軟骨保護作用。DNA含量檢測結(jié)果說明APS具有一定的抵抗凋亡和促進軟骨細胞增殖的作用，綜合GAG分泌量檢測結(jié)果分析可知20 g/L APS實驗組的軟骨細胞增殖和軟骨保護效果最佳。有研究報道TNF-α和IL-6等細胞炎性因子可通過促進炎癥反應(yīng)來參與OA的進展，從qPCR結(jié)果可知，APS對IL-1β誘導(dǎo)的體外OA軟骨細胞具有促進軟骨細胞外基質(zhì)的分泌和對抗炎癥的作用；且ELISA實驗結(jié)果也充分展示高劑量APS實驗組顯著下調(diào)TNF-α和IL-6基因的表達；通過HE染色觀察各組細胞形態(tài)可知APS能對抗IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞的炎性損傷，維持軟骨細胞的正常形態(tài)；番紅O染色結(jié)果表明APS干預(yù)處理后會促進OA的軟骨細胞分泌軟骨基質(zhì)GAG；免疫熒光結(jié)果也顯示高劑量APS實驗組顯著降低了MMP-13的表達水平［20-21］。上述研究均證明APS可通過抑制促炎因子的產(chǎn)生而減輕炎癥反應(yīng)，而核因子（NF）-κB通路在IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。也有研究表明，蘆薈素可劑量依賴性地抑制NF-κB的激活，減輕骨溶解，是一種有效的破骨形成和骨吸收抑制劑［22-23］。研究顯示，蛋白激酶C（PKC）抑制劑能夠通過抑制破骨形成和炎癥反應(yīng)來治療早期骨關(guān)節(jié)炎［24］。因此，APS作為PKCδ抑制劑，可通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎的同時抑制破骨作用，有效調(diào)節(jié)早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨穩(wěn)態(tài)，但相關(guān)作用機制有待后續(xù)研究。在成熟的DMM骨關(guān)節(jié)炎的動物模型中，染色結(jié)果顯示APS可維持DMM術(shù)后SD大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞表型和調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，表明APS治療SD大鼠骨關(guān)節(jié)炎有效。

綜上所述，APS對SD大鼠骨關(guān)節(jié)炎有治療作用，其機制可能是通過抑制促炎因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，同時促進軟骨特異性基因的表達和細胞外基質(zhì)的分泌來維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。因此，APS可作為一個治療OA的潛在候選藥物。若要作為臨床藥物，還需進一步探究藥物具體作用機制并展開相關(guān)臨床研究。