朱子鵬，劉 娜，李 影，王 辰,2，張 璇,2，顧 斌

1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科研究所，北京 100853

牙 髓干細(xì) 胞(dental pulp stem cells，DPSCs)于2000年由Gronthos等[1]在人恒牙牙髓組織中分離培養(yǎng)出，其可多向分化、高度增殖，并且能形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。還能夠分化為脂肪、肌肉、軟骨、神經(jīng)等細(xì)胞類型。由于其獲取方便、易于保存，逐漸成為組織細(xì)胞工程中的研究熱點(diǎn)。牙髓干細(xì)胞可以通過(guò)誘導(dǎo)活化T細(xì)胞參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，是一種理想的干細(xì)胞來(lái)源，為神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療提供了一種新思路[2]。目前認(rèn)為牙髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞參與組織工程有一定優(yōu)勢(shì)，但其免疫學(xué)特性及作用機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)研究腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)可以通 過(guò) 核 轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路促進(jìn)DPSCs向成骨細(xì)胞分化[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)DPSCs可使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著增加，輔助性T17細(xì)胞減少[4]。CD3+T細(xì)胞是主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。所以在本實(shí)驗(yàn)中，我們用TNF-α刺激細(xì)胞模擬炎癥微環(huán)境，初步探索在炎癥微環(huán)境中DPSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)后成骨細(xì)胞相關(guān)因子、炎性因子和Wnt經(jīng)典通路因子的mRNA表達(dá)情況。

材料和方法

1 材料 α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco美國(guó))；PBS緩沖液(HyClone美國(guó))、Ⅰ型膠原酶(Sigma美國(guó))、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco美國(guó))、青鏈霉素(Gibco美國(guó))。人牙髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基、人牙髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(Cyagen美國(guó))、外周淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco美國(guó))。CCK8試劑盒(日本同仁)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國(guó))；RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；引物(華大基因)，超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。CO2恒溫孵箱(Thermo，美國(guó))。

2 樣本收集 2020年8月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔頜面外科門診獲得離體阻生齒8顆，來(lái)源于18～35歲成年男性。所有阻生齒要求無(wú)齲壞、牙周組織健康、無(wú)牙髓炎及根尖周炎；所有患者無(wú)系統(tǒng)性疾病，血常規(guī)指標(biāo)正常，無(wú)吸煙史，半年內(nèi)無(wú)用藥史。另從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心輸血科獲取人外周血白膜層細(xì)胞濃縮樣本4份，來(lái)源于20～40歲成年男性，捐獻(xiàn)者身體健康，近半年無(wú)服藥史。以上樣本獲取均經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得捐獻(xiàn)者的知情同意。

3 牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 拔牙前充分消毒，將脫落下來(lái)的牙放入含1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，在無(wú)菌操作臺(tái)中使用大量PBS溶液對(duì)離體磨牙進(jìn)行表面沖洗，劈冠法取出牙髓并剪碎，裝入含有Ⅰ型膠原酶的EP管中，放入37℃恒溫箱1 h，期間每隔20 min震蕩一下。2 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸混勻后加入培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)7～10 d。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%時(shí)使用胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，標(biāo)記為第1代。使用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，并使用第3～5代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 CD3+T細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將取得的外周血放入抗凝管中。取10 mL全血加入等體積的PBS溶液混合均勻，向其中先加入20 mL人淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心30 min。取出離心后的液體分為三層，用吸管緩慢吸取中間的白膜層，主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，即外周血單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞吸入到15 mL離心管中，加入少量Buffer緩沖液，然后在溶液中加入5 μL CD3+免疫磁珠并混勻，避光孵育20 min，300 g離心10 min，在磁力分選架上分選獲得CD3+T細(xì)胞。將CD3/CD28免疫磁珠預(yù)先洗滌后與CD3+T細(xì)胞1∶1混合培養(yǎng)用來(lái)細(xì)胞激活，3 d后將細(xì)胞和磁珠分離，獲得的細(xì)胞加入含有白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的RPMI 1640培養(yǎng)液中刺激生長(zhǎng)，于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2 × 106/mL傳代培養(yǎng)。

5 TNF-α刺激DPSC后CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 選擇P3代的DPSCs以1 × 105/mL的密度接種于4個(gè)96孔板中，每板共接種4組，其中3組為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞分別用TNF-α濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)刺激24 h；1組為對(duì)照組，對(duì)照組中加入不含有TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)細(xì)胞1 d、3 d、5 d、7 d后每孔分別加入10 μL CCK8溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

6 DPSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 將P3代細(xì)胞接種到兩個(gè)6孔板中，兩個(gè)板分別標(biāo)記為正常組和刺激組，以2 × 105/mL的細(xì)胞密度接種，其中刺激組的細(xì)胞用10 ng/mL TNF-α提前刺激24 h。每孔加入含有1%青鏈霉素、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度匯合至60%時(shí)去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS沖洗，換成2 mL成骨培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，21 d時(shí)用PBS溶液沖洗細(xì)胞板，用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入茜素紅染色液染10 min，然后洗去染色液，并在顯微鏡下觀察后拍照。

7 DPSCs向成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 將P3代細(xì)胞以2 × 105/mL的細(xì)胞密度接種，每孔加入含有1%青鏈霉素、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度匯合至60%時(shí)去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗，改為2 mL成脂培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，直到24 d后棄液，PBS溶液沖洗細(xì)胞板，用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入油紅O染色液染10 min，洗去染色液，顯微鏡下觀察后拍照。

8 DPSCs與CD3+T細(xì)胞直接共培養(yǎng) 將DPSCs消化接種到48孔板中，接種密度為1 × 104/mL，每孔補(bǔ)液至500 μL，待24 h后細(xì)胞貼壁，計(jì)數(shù)CD3+T細(xì)胞混懸液密度為2 × 106/mL。按照上述計(jì) 數(shù) 將DPSCs：CD3+T細(xì) 胞 按1∶0、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100比例混合共培養(yǎng)。加入前每組先吸出細(xì)胞液0 μL、25 μL、50 μL、125 μL、250 μL，再向每組分別加入0 μL、25 μL、50 μL、125 μL、250 μL CD3+T細(xì)胞混懸液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)副孔，培養(yǎng)48 h，正常組細(xì)胞接種后用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，TNF-α刺激組需要將接種后的DPSCs用10 ng/mL TNF-α的培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)24 h。

9 qPCR檢測(cè)DPSCs的炎性因子、Wnt通路相關(guān)因子的mRNA表達(dá) 48 h后吸出CD3+T細(xì)胞懸液，向孔板內(nèi)用PBS緩沖液沖洗兩次，留下貼壁生長(zhǎng)的DPSCs。每孔加入Trizol裂解細(xì)胞，提取RNA，測(cè)濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL。引物序列如表1。反應(yīng)條件：95℃變性20 min，95℃退火30 s，60℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到的結(jié)果取均值。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers of qPCR

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)觀察 分離原代DPSCs，體外培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)到少量組織塊貼壁于培養(yǎng)皿上(圖1A)，3 d后明顯可見(jiàn)有貼壁細(xì)胞長(zhǎng)出，呈集落樣的不規(guī)則形態(tài)(圖1B)。10 d后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞密度生長(zhǎng)匯合至80%開(kāi)始傳代，且生長(zhǎng)速度明顯加快，傳代后第1代細(xì)胞呈紡錘狀和長(zhǎng)條狀，并呈漩渦狀生長(zhǎng)(圖1C)。

圖1 DPSCs體外分離培養(yǎng)光鏡下觀察(100×) A：原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h；B：原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d；C：P1代細(xì)胞Fig.1 Observation of DPSCs isolated and cultured in vitro under light microscope (100×) A: Primary cells were cultured for 24 h; B:Primary cells were cultured for 3 d; C: Passage one cells

2 CCK8法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL濃度TNF-α刺激下的DPSCs培養(yǎng)7 d，用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，在1 d、3 d、5 d時(shí)生長(zhǎng)曲線基本重合，7 d時(shí)可見(jiàn)10 ng/mL TNF-α刺激下的細(xì)胞增殖效果明顯，而對(duì)照組的細(xì)胞增殖相對(duì)變慢(圖2)。

圖2 CCK8法檢測(cè)不同處理組DPSCs細(xì)胞增殖Fig.2 CCK8 assay showing the growth of DPSCs in different groups

3 DPSCs的多向分化能力觀察 經(jīng)過(guò)21 d的成骨誘導(dǎo)分化后，鏡下可以見(jiàn)到鈣結(jié)節(jié)，并且在10 ng/mL TNF-α的刺激下有更為明顯的鈣沉積，同時(shí)染色更深(圖3A ～ 圖3D)；經(jīng)過(guò)24 d的成脂誘導(dǎo)，鏡下可以見(jiàn)到脂滴的形成(圖3E)。說(shuō)明DPSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的多項(xiàng)分化誘導(dǎo)能力，且TNF-α刺激下其成骨能力也明顯增強(qiáng)。

圖3 正常組DPSCs成骨分化誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色(A、C，200×)；TNF-α刺激組DPSCs成骨分化誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色(B、D，200×)；正常組DPSCs成脂分化誘導(dǎo)24 d，油紅O染色(E，200×)Fig.3 Osteogenic differentiation of DPSCs at 21 days after induction in the normal group by alizarin red staining (A, C, 200×).Osteogenic differentiation of DPSCs in TNF-α stimulation group at 21 days after induction by alizarin red staining (B, D,200×). Adipogenic differentiation of DPSCs in the normal group at 24 days after induction by oil red O staining (E,200×)

4 正常組及TNF-α刺激組DPSCs成骨因子和炎性因子表達(dá)水平 成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d，qPCR結(jié)果顯示，10 ng/mL TNF-α刺激組的Runx2表達(dá)是正常成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的1.674倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺激組的ALP表達(dá)是正常成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的1.515倍(P＜0.05)(圖4)。說(shuō)明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs向成骨細(xì)胞分化能力明顯增強(qiáng)。正常及TNF-α刺激組DPSCs接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)7 d，qPCR結(jié)果顯示，10 ng/mL TNF-α刺激組的IL-1β表達(dá)是正常組的2.314倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺 激 組 的TNF-α表達(dá)是正常組的1.947倍(P＜0.05)(圖5)。說(shuō)明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平明顯增加。

圖4 qPCR檢測(cè)經(jīng)過(guò)常規(guī)培養(yǎng)(Undiff)和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)(Diff) 7 d后正常組DPSCs和TNF-α刺激組DPSCs的Runx2和ALP的mRNA表達(dá)水平Fig.4 mRNA expression levels of Runx2 and ALP detected by qPCR after 7 days of routine culture (Undiff) and osteoblast induction culture (Diff) in the normal group and the TNF-α stimulation group

圖5 正常組DPSCs和TNF-α刺激組DPSCs常規(guī)培養(yǎng)后IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平Fig.5 mRNA expression levels of IL-1 β and TNF- α in the normal group and the TNF-α stimulation group after routine culture

5 CD3+T細(xì)胞分離共培養(yǎng)觀察 人外周血加入等量淋巴分離液，離心后取中間白膜層，利用磁珠分選得到CD3+T細(xì)胞，刺激活化后得到生長(zhǎng)良好、活性正常的懸浮狀球形細(xì)胞。然后選擇直接共培養(yǎng)的方法將DPSCs和CD3+T細(xì)胞直接混合，共同生長(zhǎng)(圖6)。

圖6 CD3+ T細(xì)胞(A)光鏡下觀察(200×)及與DPSCs直接共培養(yǎng)后(B)光鏡下觀察(200×)Fig.6 Morphological images of CD3+ T cells (A, 200×) and CD3+ T cells co-cultured with DPSCs directly (B, 200×) under light microscope

6 正常組HDPSCs和TNF-α刺激組IDPSCs分別與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)后炎癥和Wnt通路相關(guān)因子的表達(dá) 將DPSCs與CD3+T細(xì)胞按照1∶10～1∶100的比例共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)正常組在1∶20時(shí)IL-1β、TNF-α和LEF-1表達(dá)分別是DPSCs單獨(dú)培養(yǎng)的0.314倍(P＜0.05)、0.247倍(P＜0.05)和0.680倍(P＜0.05)。而TNF-α刺激組在1∶20時(shí)IL-1β、TNF-α、β-catenin和 淋 巴 樣 增 強(qiáng) 因 子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF-1)表 達(dá) 分 別 是DPSCs單獨(dú)培養(yǎng)的0.174倍(P＜0.05)、0.321倍(P＜0.05)、1.416倍(P＜0.05)和1.33倍(P＜0.05)。正常組在1∶50時(shí)IL-1β、TNF-α和LEF-1表達(dá)分別是DPSCs單獨(dú)培養(yǎng)的0.213倍(P＜0.05)、0.383倍(P＜0.05)和0.490倍(P＜0.05，TNF-α刺激組在1∶50時(shí)IL-1β、TNF-α表達(dá)分別是對(duì)照組的0.255倍(P＜0.05)、0.446倍(P＜0.05)。說(shuō)明在10 ng/mL TNF-α的刺激下，共培養(yǎng)比例為1∶20時(shí)CD3+T細(xì)胞能夠比較有效地抑制炎癥反應(yīng)，且激活了Wnt/β-catenin經(jīng)典通路，使β-catenin和LEF-1表達(dá)增加。見(jiàn)圖7。

圖7 正常組(aP＜0.05, vs HDPSCs)及TNF-α刺激組(aP＜0.05, vs IDPSCs)與CD3+ T細(xì)胞共培養(yǎng)后炎癥和Wnt通路因子的mRNA表達(dá)Fig.7 mRNA expression of inflammation and Wnt pathway factors in the normal group (aP＜0.05, vs HDPSCs) and the TNF-α stimulation group (aP＜0.05, vs IDPSCs) after co-culture with CD3+ T cells

討 論

DPSCs因其具有易獲取、成本低、多向分化能力等特點(diǎn)，成為當(dāng)下組織工程種子細(xì)胞的研究熱點(diǎn)，在組織損傷、炎癥修復(fù)等方面具有越來(lái)越廣泛的應(yīng)用前景。

在細(xì)胞水平上，DPSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，其表現(xiàn)出較高的堿性磷酸酶活性水平。此外，DPSCs顯示出較高水平的成骨和成牙分化標(biāo)志物，說(shuō)明DPSCs接近成牙本質(zhì)細(xì)胞的表型，為人牙組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞治療提供一種新思路[5]。Gong等[6]研究發(fā)現(xiàn)EPhinB2/EphB4信號(hào)在調(diào)節(jié)DPSCs誘導(dǎo)新生血管生成能力中有重要作用。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α參與炎癥發(fā)生和發(fā)展的全過(guò)程，是炎癥反應(yīng)中最為關(guān)鍵的核心因子。TNF-α是一系列抗炎過(guò)程中的上游因子，有效減少Runx2的表達(dá)。已有文獻(xiàn)證明高濃度的TNFα通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了DPSCs中礦化及礦化相關(guān)基因的表達(dá)[8]。也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α可以抑制DPSCs的成骨和成牙本質(zhì)的分化能力[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度為10 ng/mL時(shí)對(duì)DPSCs的促進(jìn)增殖效果最明顯，此時(shí)細(xì)胞活性較好。也有文獻(xiàn)證實(shí)該濃度條件下炎性因子的表達(dá)最為顯著[11]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇10 ng/mL TNFα作為刺激物模擬炎癥微環(huán)境。

在牙髓組織修復(fù)或再生的過(guò)程中，DPSCs與局部炎癥微環(huán)境相互作用，影響牙本質(zhì)修復(fù)再生[12]。炎癥反應(yīng)的過(guò)程中常有免疫細(xì)胞的參與。牙髓干細(xì)胞較骨髓干細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，可以更好地用來(lái)治療免疫性疾病[13]。慢性牙周炎的早期病變期有大量的淋巴浸潤(rùn)，主要為T淋巴細(xì)胞。在成熟的T細(xì)胞表面均會(huì)表達(dá)CD3分子[14]，CD3+T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其具有抗原特異性，同時(shí)也是同源免疫記憶的關(guān)鍵核心，因此更好地了解調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，將有利于改進(jìn)DPSCs的免疫調(diào)節(jié)治療策略[15]。這幾年最新的研究開(kāi)發(fā)出一種無(wú)血清的人工胸腺器官系統(tǒng)，這為研究人類T細(xì)胞分化和未來(lái)以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的工程T細(xì)胞療法的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具[16]。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在DPSCs和CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶20時(shí)抑炎效果最好，同時(shí)也能夠激活Wnt經(jīng)典通路，所以我們選擇此比例作為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)。

Wnt通路是由經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/Ca2+和Wnt/PCP信號(hào)通路組成。Wnt/βcatenin信號(hào)通路是機(jī)體各種信號(hào)中較為保守的一種，其可以調(diào)節(jié)多種生物生理過(guò)程，尤其是在骨細(xì)胞生物學(xué)中應(yīng)用極廣，促進(jìn)DPSCs的成骨向分化，而β-catenin的過(guò)度表達(dá)也足以抑制DPSCs的分化和礦化[17]。有研究表明炎癥微環(huán)境下間充質(zhì)牙源性干細(xì)胞的生長(zhǎng)以及分化過(guò)程中經(jīng)典以及非經(jīng)典通路之間存在著拮抗作用[18]。同時(shí)Wnt通路的主要作用靶點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄因子LEF-1和TCF上，它們是Wnt信號(hào)通路的主要下游效應(yīng)因子[19]。當(dāng)前很多研究均表明Wnt通路與干細(xì)胞的干性相關(guān)。其中抑制Wnt信號(hào)的可以達(dá)到抑制DPSCs的遷移、堿性磷酸酶表達(dá)和礦化的目的[20]。Lu等[21]通過(guò)Wnt1/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控DPSCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。因此可以推測(cè)在牙髓損傷的早期，可以通過(guò)改變Wnt信號(hào)通路恢復(fù)DPSCs的增殖能力，加快損傷修復(fù)的過(guò)程。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)激活Wnt/β-catenin途徑可以使DPSCs促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，提示其未來(lái)可能有助于指導(dǎo)齲病的治療。Uribe-Etxebarria等[23]發(fā)現(xiàn)小分子和(或)重組蛋白對(duì)Wnt信號(hào)的短暫預(yù)處理激活了培養(yǎng)中DPSCs的干性，這為優(yōu)化其他組織特異性干細(xì)胞的治療用途提供了一種新的思路。另有研究發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL TNF-α的刺激可增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑SIRT1的表達(dá)，進(jìn)而可以增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化[24]。

Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)DPSCs的干性和多能性核心因子的表達(dá)[25]。本研究結(jié)果顯示，正常組 -1∶100共培養(yǎng)比例組β-catenin表達(dá)水平是正常組 -未共培養(yǎng)組的1.537倍(P＜0.05)，在10 ng/mL的TNF-α的刺激后1∶20的共培養(yǎng)比例組β-catenin表達(dá)水平是未共培養(yǎng)組的1.416倍(P＜0.05)，這是否可以說(shuō)明在CD3+T細(xì)胞這類免疫細(xì)胞的參與下激活了Wnt/β-catenin經(jīng)典通路，進(jìn)一步調(diào)控著細(xì)胞的成骨、炎癥反應(yīng)和組織的損傷修復(fù)？目前對(duì)于DPSCs的研究我們只是管中窺豹，許多未知的問(wèn)題亟待了解和解決，盡管其中許多免疫機(jī)制我們還不盡了解，但許多研究已經(jīng)讓我們能夠初步梳理出DPSCs在各種微環(huán)境中的生物學(xué)過(guò)程，感受到了其未來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。其在不同微環(huán)境下的免疫反應(yīng)和狀態(tài)還有待我們進(jìn)一步研究。