邵玉寶，鮑蘭馨，汪陶榮，李文昊，周文瀚，戴錦辰，陳萌檬，葉 靜，趙大海，陳曉宇,

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.組織胚胎學(xué)教研室、2.病理學(xué)與病理生理學(xué)、3.形態(tài)學(xué)實驗中心、4.臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 合肥 230032；5.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 230601)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性的免疫疾病，通常表現(xiàn)為手腳關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，周圍血管和神經(jīng)也可能會參與其中[1]。在RA關(guān)節(jié)中經(jīng)常觀察到的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的慢性激活以及相關(guān)的缺氧和低血糖水平，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)造成了相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)，最終可能導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)一起被激活[2]。UPR會促進(jìn)ER膜上蛋白活化轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor 6，ATF6)發(fā)生剪切，進(jìn)一步激活PI3K-AKT-NF-κB通路，促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)生；同時激活PERK的磷酸化，激活下游eIF2α磷酸化，最終促進(jìn)NF-κB的活化[3]。中腦膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor，MANF)與BIP78以鈣依賴形式相互作用定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。當(dāng)炎癥發(fā)生時，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放入胞質(zhì)，MANF分泌。MANF可減輕多種由ER應(yīng)激所引起的損傷，如減小肝損傷，促進(jìn)神經(jīng)再生，角膜修復(fù)，抑制骨關(guān)節(jié)炎等[4-5]。研究表明，MANF能夠抑制膠原誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[4]。在肝癌細(xì)胞中，MANF在SUMO蛋白的作用下向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與核因子p65(nuclear factor kappa-B p65，p65)結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性[5]。

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的干燥根皮中提取物出來的一種有效成分，具有廣泛的抗炎活性[6]。丹皮酚具有良好的對抗ER應(yīng)激效果，可以改善衣霉素?fù)p傷的小鼠主動脈的內(nèi)皮依賴性舒張，通過5'腺苷單磷酸激活的蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活的受體δ激活，進(jìn)一步降低ER應(yīng)激水平及GRP78、ATF6、eIF2α蛋白表達(dá)及ROS的過量生產(chǎn)并提高NO的生物利用度[7-9]。

目前，丹皮酚與MANF的關(guān)系尚不明確，丹皮酚是否會影響MANF的表達(dá)，是否會影響MANF細(xì)胞質(zhì)/核易位。本文主要研究丹皮酚通過對MANF蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞質(zhì)/核易位的調(diào)控對RA成纖維滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞(RA-FLSs)購買于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。TRIzol(15596026)，購買于InvitrogenTM；NEAA(PB180424)、ITS-A(PB180430)、NaP(PB180422)及胎牛血清(164210)購買于普諾賽生命科技；DMEM培養(yǎng)基(SH30022.01)購買于Hyclone；CCK-8(C0037)購買于碧云天生物技術(shù)；TNF-α(H8916)購買于Sigma公司；MANF(ab67271)、p65(8242T)與Actin(ab8226)購買于Abcam；N-cadherin(3195S)、Vimentin(5741S)、β-Tublin(15115S)、GAPDH(5174S)與Lamin-B(17416S)購買于Cell Signaling Technology；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)購買于Takara公司；實時熒光定量試劑盒Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen(4385610)購買于ThermoFisher公司；

1.1.2儀器 激光掃描共聚焦顯微鏡LSM880(德國)；電泳儀(DYY-10，北京六一儀器廠)；Image-Pro plus 圖像處理系統(tǒng)；熒光定量儀PCR-ABI(賽默飛世爾科技，美國)；多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer，美國)；GraphPad Prism 7.00數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RA-FLSs培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的非必須氨基酸(NEAA)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS-A,1mmol·L-1)、丙酮酸鈉(NaP)及1%的胎牛血清(FBS)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制 將對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪在96孔板中，每孔100 μL(1 000個細(xì)胞)，使用TNF-α(10 μg·L-1)刺激12 h后，加丹皮酚處理48 h。更換新鮮培養(yǎng)基，每孔添加10 μL CCK-8檢測試劑，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測460 nm處吸光度值。

1.2.3免疫印跡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，鋪6孔板中，待細(xì)胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理24 h，獲取細(xì)胞沉淀塊。細(xì)胞重懸在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，添加2 X SDS裂解液(100 mmol·L-1Tris-Cl(pH 6.8)、4%(W/V)SDS、20%(V/V)Glycerol、200 mmol·L-1DTT(Dithiothreitol))得蛋白溶液，其中PBS ∶2 X SDS=1 ∶1(V/V)。使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，SDS-PAGE電泳時每個孔道加10 μg蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，4 ℃孵育一抗MANF、NF-κB-p65、Actin、GAPDH、β-Tublin、Lamin-B、ATF6、N-cadherin、Vimentin(1 ∶1 000)過夜；二抗于室溫孵育1 h，使用TBST洗3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光曝光1-5 min，顯影。

1.2.4實時熒光定量PCR 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，鋪6孔板中，待細(xì)胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理24 h，獲取細(xì)胞沉淀塊，使用TRIzol進(jìn)行裂解及RNA提取。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(100 μg·L-1)作為模板，加入IL-6(5 μmol·L-1)和TNF-α(5 μmol·L-1)引物，使用SYBR Green預(yù)混液擴增mRNA，擴增程序設(shè)置為35個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)，在熒光定量PCR儀中檢測熒光信號。以未處理組為對照，通過2^-ddCt方法進(jìn)行定量分析，獲取不同處理方式中mRNA水平的表達(dá)情況。引物信息如下：IL-6，正向“5′-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTC-3′”,反向“5′-AGAGGTGAGTGGCTGTCTGTGT-3′”；TNF-α：正向“5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′”，反向“5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′”。

1.2.5細(xì)胞遷移 使用記號筆在6孔板底部畫水平橫線，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，鋪6孔板中，待細(xì)胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理48 h。使用槍頭在6孔板中垂直畫線以確定每次觀察位置相同，PBS洗去漂浮細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基，于顯微鏡下拍照。將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，選取相同的位置再次拍照，通過ImageJ統(tǒng)計空白處面積所占比例，以比較不同處理方式中細(xì)胞的遷移效率。

1.2.6免疫熒光 細(xì)胞爬片經(jīng)消毒滅菌后置于6孔板中，將處于對數(shù)生長期的RA-FLSs鋪于細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，使用丹皮酚(50 μmol·L-1)處理24 h。移除培養(yǎng)基，PBS洗3次，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定10 min，30 g·L-1的BSA封閉1 h后使用p65(1 ∶50)與MANF(1 ∶100)抗體進(jìn)行免疫一抗標(biāo)記，4 ℃孵育12 h；熒光二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，DAPI室溫孵育10 min，洗去殘留二抗及DAPI后封片。使用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞中p65與MANF蛋白的表達(dá)量及表達(dá)位置。

1.2.7核蛋白分離 RA-FLSs經(jīng)過TNF-α處理12 h后，加丹皮酚處理24 h。將收取的細(xì)胞團塊用細(xì)胞質(zhì)裂解液(10 mmol·L-1HEPES、1.5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1的KCl、0.5 mmol·L-1的DTT、0.05%(V/V)的NP-40，pH 7.9)進(jìn)行重懸，同時在其中加入蛋白酶體抑制劑及PMSF試劑，冰上裂解40分鐘，收取上清即為胞質(zhì)蛋白。將沉淀使用細(xì)胞核裂解液(5 mmol·L-1HEPES、1.5 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1EDTA、0.5 mmol·L-1DTT、26%(V/V)甘油，pH 7.9)進(jìn)行重懸，冰上裂解30 min后離心，所得上清即為細(xì)胞核蛋白。通過Western blot檢測MANF和p65的細(xì)胞質(zhì)/核易位水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計學(xué)軟件，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式呈現(xiàn)，兩組間的值的比較以t檢驗，多組間均數(shù)差異性比較以單因素方差分析(One-way ANOVA)為主，兩兩比較采用SNK-q分析。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚抑制滑膜細(xì)胞的異常增殖檢測RA-FLSs對丹皮酚的耐受程度，F(xiàn)ig 1 A所示，當(dāng)?shù)てし訚舛鹊陀?00 μmol·L-1時，不會影響FLSs的活性(t=2.856，P=0.4448)。使用TNF-α(10 μg·L-1)刺激FLSs細(xì)胞12 h，丹皮酚(1、10、50、100 μmol·L-1)處理細(xì)胞48 h，結(jié)果Fig 1 B所示，對處于炎癥狀態(tài)下的FLSs，丹皮酚達(dá)到50 μmol·L-1可對其異常增殖產(chǎn)生抑制作用(t=4.497，P=0.0394)。

2.2 丹皮酚抑制滑膜細(xì)胞的遷徙細(xì)胞遷移實驗顯示Fig 2 A，與TNF-α組相比，丹皮酚濃度為100 μmol·L-1對RA-FLS的遷徙產(chǎn)生抑制作用(t=8.998，P=0.001)。進(jìn)一步研究了丹皮酚對細(xì)胞遷徙相關(guān)蛋白N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的影響。如Fig 2 B所示，與對照組相比，TNF-α組N-cadherin、Vimentin蛋白水平均升高；與TNF-α組相比，丹皮酚(100 μmol·L-1)處理48 h能夠降低N-cadherin(t=22.9，P=0.001)、Vimentin(t=29.69，P=0.001)。

Fig 1 Paeonol can inhibit the abnormal proliferation of fibroblast synoviocytes induced by TNF-α

Fig 2 Paeonol can inhibit the expression of migration-related protein

2.3 丹皮酚通過ER應(yīng)激增加MANF的表達(dá)使用Western blot方法檢測丹皮酚對RA-FLSs中MANF蛋白表達(dá)變化。如Fig 3所示，F(xiàn)LSs經(jīng)過TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚(1、10、100 μmol·L-1)處理24 h，與對照組相比，TNF-α組中細(xì)胞MANF表達(dá)增加(t=9.498，P<0.01)；與TNF-α組相比，1 μmol·L-1丹皮酚處理后即可觀察到MANF增加(t=19.45，P<0.01)，MANF上游蛋白ATF6變化趨勢與MANF基本保持一致。

2.4 免疫熒光觀察丹皮酚促進(jìn)MANF的核位移通過免疫熒光檢測，對轉(zhuǎn)錄因子p65及MNAF蛋白的表達(dá)情況即細(xì)胞定位進(jìn)行檢測。結(jié)果如Fig 4 A、B顯示，與對照組相比，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h后的FLSs尚不能觀察到MANF的細(xì)胞質(zhì)/核易位增加。與TNF-α組相比，使用丹皮酚(50 μmol·L-1)處理24 h后，MANF細(xì)胞質(zhì)/核易位水平增加(t=21.16，P<0.01)。

2.5 核蛋白檢測丹皮酚促進(jìn)MANF的核位移為了對丹皮酚促進(jìn)MANF細(xì)胞質(zhì)/核易位的程度進(jìn)行量化，通過對RA-FLSs細(xì)胞的核蛋白與胞質(zhì)蛋白進(jìn)行分離，分別檢測其中的p65與MANF蛋白表達(dá)。如Fig 5顯示，在細(xì)胞核中，MANF蛋白水平在丹皮酚(10 μmol·L-1)處理后升高(t=38.81，P<0.01)；與之對應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子p65在經(jīng)過TNF-α(10 μg·L-1)誘導(dǎo)后入核明顯，當(dāng)使用丹皮酚(10 μmol·L-1)處理后，細(xì)胞核中p65水平降低(t=3.541，P<0.01)。同時可以觀察到，在胞質(zhì)蛋白中，p65蛋白變化水平與細(xì)胞核內(nèi)變化趨勢相反，當(dāng)TNF-α刺激后，細(xì)胞質(zhì)中p65水平降低，當(dāng)使用丹皮酚處理后，細(xì)胞質(zhì)中p65蛋白水平恢復(fù)。

2.6 丹皮酚抑制滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)通過RT-qPCR檢測炎癥因子mRNA，如Fig 6 A、B所示，與TNF-α(10 μg·L-1)組相比，丹皮酚(10 μmol·L-1)能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的mRNA異常轉(zhuǎn)錄(t=9.233，P<0.01;t=6.053，P<0.01)。通過在FLS細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)p65-promoter，研究丹皮酚對p65轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制，結(jié)果如Fig 6 C所示，TNF-α刺激可增強p65的轉(zhuǎn)錄活性(t=38.81，P<0.01)，而丹皮酚(1、10、50、100 μmol·L-1)可以劑量依賴性降低p65的轉(zhuǎn)錄活性，且當(dāng)濃度為1 μmol·L-1即有統(tǒng)計學(xué)意義(t=44.09，P<0.01)。

3 討論

天然產(chǎn)物丹皮酚具有良好的抗炎效果，在傳統(tǒng)中藥中已被廣泛使用，其安全性有足夠的保證[8]。在研究RA的過程中，以FLSs當(dāng)作研究模型，F(xiàn)LSs在RA的疾病發(fā)展中起到重要作用[10]。本研究首先對丹皮酚安全性進(jìn)行驗證，當(dāng)?shù)てし訚舛冗_(dá)到100 μmol·L-1時，不會對FLSs活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。RA表現(xiàn)為RA-FLSs細(xì)胞的異常增殖及侵襲，藥物通過抑制RA-FLSs細(xì)胞異常增殖產(chǎn)生對RA的抑制作用[10]。鈣黏附蛋白N-cadherin和波形蛋白Vimentin在細(xì)胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。研究中，丹皮酚對RA-FLSs的異常增殖及N-cadherin和Vimentin蛋白水平均產(chǎn)生抑制(Fig 2B)。

RA形成的原因復(fù)雜，多種細(xì)胞參與其中，如B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、FLS細(xì)胞等[13]。而MANF是一種分泌蛋白，其表達(dá)和分泌量的增加有助于在不同種類細(xì)胞間產(chǎn)生其保護(hù)作用[14]。如MANF可以促進(jìn)免疫細(xì)胞表型從促炎性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)性抗炎性巨噬細(xì)胞[12]。MANF啟動子ERSE-Ⅱ受ATF6所調(diào)控，其分泌與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平密切相關(guān)[15-16]。MANF上游ER應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF6表達(dá)在丹皮酚作用下維持在較高水平(Fig 3)。當(dāng)RA-FLSs細(xì)胞中MANF表達(dá)量增高，又可以進(jìn)一步對周圍其他參與RA進(jìn)展的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，與藥物形成協(xié)同，預(yù)期可以產(chǎn)生更好的炎癥抑制效果。與直接使用MANF純化蛋白進(jìn)行相比，丹皮酚使用成本更低。

Fig 3 Paeonol promoted MANF expression

Fig 4 Paeonol increased level of protein MANF in nucleus

中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)首次發(fā)現(xiàn)是作為一種星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的一種新的多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子[17]。最近的研究表明，MANF可以在SUMO的介導(dǎo)下，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，通過與轉(zhuǎn)錄因子p65結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性而產(chǎn)生炎癥抑制作用[10]。通過免疫熒光及核、漿蛋白分離實驗，證明丹皮酚能夠促進(jìn)MANF細(xì)胞質(zhì)/核易位(Fig 4、5)。在抑制p65轉(zhuǎn)錄活性這條通路上，增加MANF細(xì)胞質(zhì)/核易位水平，將大大提高其炎癥抑制能力。轉(zhuǎn)錄因子p65在活性狀態(tài)下能夠激活包括IL-6、IL-1β、TNF-α等多種炎癥因子的表達(dá)[18]。通過克隆p65啟動子，將其外源表達(dá)在RA-FLSs細(xì)胞中。結(jié)果顯示p65的轉(zhuǎn)錄活性劑量依賴性的受到丹皮酚影響(Fig 6)?？傊?，丹皮酚能夠有效的增加MANF蛋白的表達(dá)，并且促進(jìn)MANF蛋白的核轉(zhuǎn)移，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子p65的活性，發(fā)揮其抑制炎癥的功能。

Fig 5 Paeonol inhibits RA-FLSs inflammatory progression by promoting nuclear transfer of MANF

Fig 6 Paeonol can produce an inflammatory effect by inhibiting the transcriptional activity of p65