陳巖巖，葉項宇，常肖銳，徐碧林，呂銳玲，鄭永良，3

（1.黃岡師范學(xué)院a.經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室；b.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.湖北中科產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 黃岡 438000）

大別山板栗Castanea mollissima品種豐富，種植歷史悠久，被列為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。大別山板栗多生于丘陵緩坡地帶的黃棕砂質(zhì)土壤中。吳靜等[1]通過對大別山板栗根際土壤理化性質(zhì)的測定，發(fā)現(xiàn)其土壤貧瘠，有效磷含量僅8.39 mg/kg左右。磷元素在板栗生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，土壤中磷含量約為0.05%，其中可供植物吸收利用的磷僅占全磷含量的0.1%左右。

解磷微生物通過分泌一些代謝物質(zhì)，改變土壤生境，溶解或礦化土壤中難溶性磷，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤?，供植物吸收利用。解磷微生物種類豐富，包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類在內(nèi)的多種微生物均具有溶磷能力[2-3]。微生物對磷增溶的機制：微生物通過產(chǎn)生有機酸、鐵載體、質(zhì)子、氫氧根離子、二氧化碳等使礦物態(tài)磷釋放絡(luò)合物；微生物胞外酶的釋放（生化磷礦化）；底物降解期間釋放磷（生物磷礦化）[2,4]。利用微生物解決土壤缺磷問題成為國內(nèi)外的研究熱點[2,5]。以解磷微生物制成的微生物菌肥在農(nóng)業(yè)上已有所應(yīng)用。Gulati 等[6]經(jīng)研究得出，接種解磷菌BIHB723 處理的玉米植株高度、枝條鮮質(zhì)量、枝干質(zhì)量、根長、根干質(zhì)量以及土壤磷含量與對照相比均有顯著增加。此外，解磷菌在小麥、甘藍(lán)、青菜、莜麥等農(nóng)作物上均有運用[7]，有關(guān)解磷微生物在林業(yè)方面運用的研究報道較少。張晶晶等[8]從新疆核桃根際分離、篩選解磷菌，得到5 個屬的解磷微生物，其中假單胞菌的解磷效果最好，且為優(yōu)勢菌屬；鄧小軍等[9]從南方速生豐產(chǎn)林不同地區(qū)分離解磷微生物，篩選得到1 株高效解磷菌巨大芽孢桿菌。為揭示板栗根際微生物的解磷機制，本試驗中通過從板栗根際土壤分離篩選高效解磷菌，對解磷菌株的解磷性能及其對板栗的促生效應(yīng)開展了初步研究，旨在為開發(fā)應(yīng)用于野外板栗的解磷微生物菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤取樣

土壤樣品采自湖北省麻城市木子店鎮(zhèn)上馬石村大別山板栗種植實驗基地（31°15′9.92″N，115°25′29.66″E）。采用五點取樣法，取板栗根際土壤，保存于無菌采樣袋中。

1.2 培養(yǎng)基配制

解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ，以無機磷磷酸鈣為唯一磷源，配方：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、KCl 0.3 g、Ca3(PO4)22.0 g、瓊脂17 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.2～7.4[10]。此配方用于解磷細(xì)菌分離培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)基中加入鏈霉素，終質(zhì)量濃度為30 μg/mL，用于解磷真菌分離培養(yǎng)。

解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ，以有機磷卵磷脂為唯一磷源，配方：葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·2H2O 0.03 g、CaCO35.0 g、KCl 0.3 g，pH為7.2～7.4，加入新鮮蛋黃液60 mL，加蒸餾水至1 000 mL[10]。蛋黃液為蛋黃和生理鹽水體積比1∶1 的混合物。

LB 培養(yǎng)基配方：酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂17 g，加蒸餾水至1 000 mL。

1.3 解磷菌分離和鑒定

1.3.1 分 離

稱取土樣5 g，加入盛有45 mL 0.9%無菌生理鹽水的三角瓶中，30 ℃條件下180 r/min 振蕩30 min，靜置5 min。吸取1 mL 上清液于裝有9 mL 0.9%無菌生理鹽水的試管中，充分混勻，進(jìn)行10 倍梯度稀釋。將稀釋液分別涂布在解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ上，分離細(xì)菌的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，分離真菌的平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)6 d。觀察有無溶磷圈，將產(chǎn)生溶磷圈的菌株進(jìn)行反復(fù)分離和純化，直到得到純培養(yǎng)菌株。采用十字交叉法測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算菌株溶磷能力指標(biāo)溶磷指數(shù)（α）。

α=D/d。

1.3.2 鑒 定

菌株的菌落形態(tài)觀察及主要的生理生化特性測定參考文獻(xiàn)[11]。

使用試劑盒（ 生工Sangon Biotech Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒） 來提取菌株DNA，以細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進(jìn)行16S rDNA 保守基因的PCR 擴增。將PCR 產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，所測序列通過Blast 程序在GenBank 中搜索同源序列，采用Mega7.0 的Neighbor-joining 軟件進(jìn)行序列同源性比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 解磷菌解磷能力分析

1.4.1 對無機磷磷酸鈣的解磷能力

使用LB 培養(yǎng)基（未添加瓊脂），將解磷菌株進(jìn)行試管液體培養(yǎng)，用可見光分光光度計測定波長600 nm 處的吸光度，取吸光度為0.6～0.8的菌液，按1%的接種量接種到裝有50 mL 解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ（未添加瓊脂）的三角瓶中，以無菌水為對照，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，180 r/min 搖瓶培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)好的菌液在4 ℃下離心，用鉬藍(lán)比色法測定上清液的可溶磷含量[12]；用過硫酸鉀消解法在121 ℃下消化30 min，然后將液體在4 ℃下離心，用鉬藍(lán)比色法測定上清液的總磷含量；用MYR0NL 6PFC 精密pH 計（上海邁哲電子科技有限公司）測定培養(yǎng)液的pH。

1.4.2 對有機磷卵磷脂的解磷能力

將菌株P(guān)6在解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，第6 天將菌液在4 ℃下離心，用鉬藍(lán)比色法測定上清液的可溶磷含量[12]，以對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)測定培養(yǎng)液上清液中磷酸酶活性[13]。

1.5 解磷菌回接

將解磷菌液體培養(yǎng)后制成菌懸液，離心，收集菌體，加入無菌蒸餾水，用可見光分光光度計測定并使其在波長600 nm 處吸光度為0.6～0.8，按1%接種量回接到苗期60 d 的板栗組培苗土壤中，以無菌水為CK。每處理5 個重復(fù)，將盆栽置于培養(yǎng)室培養(yǎng)90 d 后采樣。測定植株的株高、莖粗、莖葉鮮質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量等指標(biāo)；測定植株不同部位的氮、磷含量；測定板栗根際土壤的基本理化性質(zhì)[14]和土壤酶活性[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗根際解磷菌的分離

使用解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ分離解磷菌，從板栗根際土壤中篩選出7 株能產(chǎn)生溶磷圈的菌株，分別命名為P1～P8（表1）。其中，P8 為解磷真菌，其他菌株為解磷細(xì)菌。平板培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測定菌株的溶磷圈直徑和菌落直徑，計算溶磷指數(shù)（α），根據(jù)α值初步判斷菌株的解磷能力，規(guī)定α 值不小于2 為溶磷能力較強的菌株。

表1 采用透明圈法篩選出的板栗根際解磷菌?Table 1 Screening of phosphate-solubilizing microorganisms in chestnut rhizosphere by transparency circle method

從表1可以看出，分離菌株的α值為1.25～2.33。其中，菌株P(guān)1和P6的α值分別為2.33、2.00，菌株在平板上形成的溶磷圈如圖1所示。

圖1 菌株P(guān)1 和P6 在平板上形成的溶磷圈Fig.1 Phosphate dissolving circle of strains P1 and P6 in medium

使用解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ（未添加瓊脂），對初篩得到的2 株菌株P(guān)1 和P6 進(jìn)行培養(yǎng)，6 d 后培養(yǎng)液中可溶磷含量與CK 相比均有所增加，分別為15.43、75.98 mg/L（圖2），分別占培養(yǎng)液中總磷含量（135 mg/L）的11.40%、56.28%。結(jié)果表明，菌株P(guān)6 的解磷能力最強，確定菌株P(guān)6 作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

圖2 初篩得到板栗根際菌株P(guān)1 和P6 培養(yǎng)6 d 后培養(yǎng)液的可溶磷含量Fig.2 Preliminary screening obtained the soluble phosphorus content of chestnut rhizosphere strains P1 and P6 after culture for 6 days

2.2 板栗根際解磷菌的鑒定

2.2.1 菌株P(guān)6 的形態(tài)及生理生化特征

將菌株P(guān)6 在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后，菌落為圓形，表面濕潤，不透明，白色，邊緣整齊，革蘭氏陰性。菌株P(guān)6 的過氧化氫酶測試、乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗、淀粉水解試驗結(jié)果均顯示陰性，吲哚試驗、明膠試驗、檸檬酸鹽試驗結(jié)果均顯示陽性。

2.2.2 菌株P(guān)6 的16s rDNA 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

提取菌株P(guān)6 的全基因組DNA，利用通用引物進(jìn)行PCR 擴增得到菌株16s rDNA 保守基因，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至Genbank，登錄號為MT176502。Blast 在線相似性分析結(jié)果表明，菌株P(guān)6 的16s rDNA 的保守基因序列與Genbank 中的Burkholderia cepaciaGJ8 同源性高達(dá)99%，結(jié)合其形態(tài)和生理生化特性，初步鑒定菌株P(guān)6 為洋蔥伯克霍爾德氏菌B.cepacia，菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖3所示。

圖3 板栗根際菌株P(guān)6 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of chestnut rhizosphere strain P6

2.3 板栗根際菌株P(guān)6 的解磷特性

2.3.1 對無機磷磷酸鈣的解磷能力

使用解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ（未添加瓊脂），對菌株P(guān)6 進(jìn)行培養(yǎng)后，培養(yǎng)液可溶磷含量及其pH 如圖4所示。由圖4可以看出，培養(yǎng)液可溶磷含量為75.98～78.84 mg/L，隨著培養(yǎng)時間延長先升高、后逐漸下降，在培養(yǎng)4 d 后達(dá)到最大值。培養(yǎng)液pH 為3.41～3.59，差異不顯著，隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增加，并趨于穩(wěn)定。

圖4 培養(yǎng)板栗根際菌株P(guān)6 的解磷菌培養(yǎng)基Ⅰ的可溶磷含量及其pH 的變化Fig.4 The content of soluble phosphorus and the change of pH in phosphate solubilizing bacteria medium I for culturing chestnut rhizosphere strain P6

培養(yǎng)液可溶磷含量與pH 之間的相關(guān)性如圖5所示。由圖5可以看出，菌株P(guān)6 培養(yǎng)液中可溶磷含量與pH 呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.703，P＜0.001，說明二者呈極顯著正相關(guān)。

圖5 板栗根際菌株P(guān)6 培養(yǎng)液可溶磷含量與其pH 的關(guān)系Fig.5 The relationship between the soluble phosphorus content and pH of chestnut rhizosphere strain P6

2.3.2 對有機磷卵磷脂的解磷能力

將菌株P(guān)6 在解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)6 d 后，培養(yǎng)液可溶磷含量及其pH 如圖6所示。由圖6可以看出，菌株P(guān)6 培養(yǎng)液中可溶磷含量為44.06 mg/L，是CK 的7.16 倍，表明菌株P(guān)6 具有溶解有機磷卵磷脂的能力。培養(yǎng)液pH 顯著下降，由5.69 降低至3.78（P＜0.05）。

圖6 培養(yǎng)板栗根際菌株P(guān)6（6 d 后）的解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ的可溶磷含量及其pHFig.6 The soluble phosphorus content and pH of phosphate solubilizing bacteria medium Ⅱ for culturing chestnut rhizosphere strain P6 (after 6 d)

將菌株P(guān)6 在解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)6 d 后，培養(yǎng)液的磷酸酶活性如圖7所示。由圖7可以看出，菌株P(guān)6 培養(yǎng)液的磷酸酶活性顯著高于CK（P＜0.05），堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性分別增加了16.62、24.61 mmol/(L·h)。

圖7 培養(yǎng)板栗根際菌株P(guān)6（6 d 后）的解磷菌培養(yǎng)基Ⅱ的磷酸酶活性Fig.7 Phosphatase activity of phosphate solubilizing bacteria medium II for culturing chestnut rhizosphere strain P6 (after 6 d)

2.4 板栗根際菌株P(guān)6 對板栗苗的促生作用

菌株P(guān)6 對板栗植株生長及其氮、磷含量的影響見表2。由表2可知，與CK 相比，接種菌株P(guān)6 后，板栗幼苗的株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量分別比CK 增加了60.70%、21.67%、204.76%、223.08%、64.00%、80.00%，其中地上部鮮質(zhì)量和地上部干質(zhì)量增加極顯著，表明接種解磷菌P6 促進(jìn)了板栗幼苗的生長。接種菌株P(guān)6 后，板栗幼苗的地上部含磷量、地下部含磷量分別比CK 顯著增加53.41%、52.33%，表明接種解磷菌P6 促進(jìn)了板栗幼苗對土壤磷素的吸收。

表2 接種菌株P(guān)6 后板栗植株的生長指標(biāo)及其氮、磷含量?Table 2 Growth index and nitrogen and phosphorus content of chestnut plant after inoculation with strain P6

菌株P(guān)6 對板栗根際土壤的理化性質(zhì)和土壤酶活性的影響見表3。由表3可知，接種菌株P(guān)6 后，土壤pH 下降，土壤有機質(zhì)、有效氮、總氮、有效磷、總磷含量分別增加了27.31%、146.86%、126.88%、85.59%、21.99%，表明接種菌株P(guān)6 后土壤環(huán)境改善。土壤酶的活性有所增加，其中堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別顯著增加了145.54%、449.27%。結(jié)果表明，回接菌株P(guān)6 對板栗幼苗生長具有明顯的促進(jìn)作用。

表3 接種菌株P(guān)6 后板栗根際土壤的理化性質(zhì)和土壤酶活性?Table 3 Physical and chemical properties and soil enzyme activity of chestnut rhizosphere soil after inoculation with strain P6

3 結(jié)論與討論

本研究中，從板栗根際篩選出1 株高效解磷菌株P(guān)6，經(jīng)鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌B.cepacea。該菌株可溶解難溶性無機磷磷酸鈣和有機磷卵磷脂，以磷酸鈣為磷源的培養(yǎng)液中可溶磷含量與其pH 顯著相關(guān)。將菌株P(guān)6 回接至板栗幼苗根際土壤中，能改善板栗土壤生境，促進(jìn)板栗苗對土壤磷的吸收，顯著促進(jìn)板栗幼苗的生長。

目前，從不同的植物根際所篩選的解磷微生物種類繁多，應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上的解磷微生物主要包括芽孢桿菌屬Bacillius、根瘤菌屬Rhizobium、青霉Penicillium等[15]。本研究中從板栗根際土壤篩選出的高效解磷菌P6 可同時利用無機磷和有機磷，培養(yǎng)6 d 后培養(yǎng)液中可溶磷含量分別達(dá)到75.98、44.06 mg/L。Braz 等[16]經(jīng)研究得出，洋蔥伯克霍爾德菌對CaHPO4的溶磷量為0.57 g/L。林啟美等[17]研究了解磷細(xì)菌對不同磷礦粉的解磷量，結(jié)果表明不同地區(qū)的磷礦粉解磷微生物的解磷能力不同。劉小玉等[18]篩選得到1 株B.capacia，該菌株對卵磷脂的溶磷量為201.38 mg/L。說明解磷微生物的溶磷能力不僅取決于微生物本身，還與磷的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，同時與微生物的種類和生境密切相關(guān)。

解磷微生物通過分泌一些代謝物降低溶液pH來溶解難溶性無機磷是較常見的一種解磷機制[19]，然而對于溶磷量與pH 之間的關(guān)系尚無定論。郝晶等[20]經(jīng)研究得出可溶磷含量與pH 之間缺乏相關(guān)性；Braz 等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥伯克霍爾德菌培養(yǎng)液的pH 范圍在4.2～5.0，可溶磷含量與pH 之間顯著相關(guān)。本研究中，菌株P(guān)6 培養(yǎng)液的pH 范圍在3.42～3.59，可溶磷含量與pH 呈極顯著相關(guān)，說明解磷微生物的解磷機制復(fù)雜，可能是因為不同菌株分泌代謝物的種類及總量有較大差異，或者多種微生物解磷機制并存。微生物通過分泌胞外酶，可使難溶性有機磷礦化，其中磷酸酶在磷元素代謝過程中發(fā)揮重要作用。Hidayat 等[21]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，酸性磷酸酶活性的抑制和解除抑制的調(diào)節(jié)，受磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)機制的控制；Braz 等[16]發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克霍爾德菌培養(yǎng)液的磷酸鹽濃度與磷酸酶活性之間的相關(guān)性不顯著。本研究中，在以卵磷脂為磷源的P6 菌株培養(yǎng)液中磷酸酶活性和溶磷量均高于CK，P6 菌株在解磷過程中調(diào)控磷酸酶活性的機制需要進(jìn)一步深入研究。

解磷菌劑不僅可以促進(jìn)植物的生長，還可促進(jìn)植物對土壤磷的吸收。呂俊等[22]接種Burkholderiasp.顯著提高了盆栽馬尾松幼苗的苗高和鮮質(zhì)量等；何雪香等[23]也研究了單接種解磷菌對秋茄苗高的促進(jìn)作用。從盆栽試驗結(jié)果來看，與CK 相比，接種菌株P(guān)6 可顯著促進(jìn)板栗幼苗的生長。閆小梅等[24]報道，接種熒光假單胞菌菌株Y1 明顯促進(jìn)了花生的生長及植株對土壤氮磷鉀的吸收；Poonguzhali 等[25]報道，將從白菜根際分離的解磷菌假單胞菌對白菜進(jìn)行回接，與CK 相比，增加了白菜的根長，但是對白菜吸收磷的影響不明顯。

向珊珊等[26]通過對大別山林地小氣候和土壤理化性質(zhì)測定，發(fā)現(xiàn)在不同季節(jié)土壤溫濕度及其理化性質(zhì)差異顯著。本研究中僅在第2 季度進(jìn)行土壤根際采樣，未考慮采樣時間的影響，下一步的研究中應(yīng)增加根際土壤采樣的次數(shù)，進(jìn)行不同季節(jié)根際土壤采樣，來分離、篩選高效解磷菌。另外，篩選得到的菌株P(guān)6 僅運用在了室內(nèi)板栗組培苗上，解磷微生物在板栗根部的定植受到多種因素的影響，實驗室條件下菌株P(guān)6 表現(xiàn)出了較好的溶解磷能力，而解磷菌株野外回接可能受多種外界環(huán)境條件影響。為給基于菌株P(guān)6 的微生物菌肥研發(fā)提供參考，可進(jìn)一步將解磷菌P6 進(jìn)行野外板栗接種試驗，研究其在板栗根際土壤的定植、對板栗的促生作用及對板栗土壤生境的影響。