張 陳，閆紅心，紀(jì) 棟，魏志豪，姚志松，CAMARA ZOUMANA，蘇有勇

（昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，昆明 650500）

0 引言

根據(jù)英國石油公司2020年統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2019年可再生能源消費(fèi)總量只占一次能源消費(fèi)量的4.9%，而其中的生物質(zhì)燃料消費(fèi)總量占比更微乎其微[1]。中國作為全球農(nóng)作物秸稈第一生產(chǎn)大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)2002年全國農(nóng)作物秸稈為6.2億t[2]，而2005年的產(chǎn)量增至8億t[3]。同樣的，人民生產(chǎn)消費(fèi)能力的提升也帶動了畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，僅2015年中國僅奶牛養(yǎng)殖就有約1200萬頭，隨之而來的是每年產(chǎn)生大量的牛糞，但利用率低[4-5]。盡管近年來政府出臺了很多限制秸稈焚燒政策，但是還有大量秸稈仍然以不同形式的形式燃燒，而燃燒所帶來的是大量的氣體污染[6-8]。農(nóng)作物秸稈和牛糞是一類含豐富纖維素類的生物質(zhì)能源，而纖維素是一種由β-D吡喃葡萄糖通過1-4糖苷鍵組成的無支鏈結(jié)構(gòu)[9]，由木質(zhì)素和半纖維素結(jié)構(gòu)包裹而很難被利用[10-11]。目前的學(xué)者大多圍繞著如何破環(huán)木質(zhì)纖維素之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)開展相關(guān)課題，主要是圍繞著物理法，化學(xué)法和生物法或者三者之間共同作用等手段達(dá)到破壞纖維素結(jié)構(gòu)的目的。微波法是物理法常用的方法之一，Sapci Z[12]使用微波預(yù)處理秸稈，產(chǎn)氣量沒有明顯提高。而化學(xué)法通常是添加酸堿試劑、微量元素或離子液體等手段破環(huán)纖維素結(jié)構(gòu)。He等[13]添加6%的氫氧化鈉預(yù)處理水稻秸稈，使產(chǎn)氣率有所提高，而且通過處理后的樣品結(jié)構(gòu)來詳述化學(xué)試劑對秸稈處理的影響。生物法主要是酶法進(jìn)行預(yù)處理秸稈樣品，Wang等[14]通過微生物產(chǎn)生的纖維素酶預(yù)處理秸稈樣品，使沼氣產(chǎn)率提升36.9%。這些方式各有利弊：物理法和化學(xué)法作用快，但是對設(shè)備要求高且對環(huán)境不友好，而生物法作用緩慢且成本高，但是基本不會產(chǎn)生對下游工藝有害的化學(xué)物質(zhì)。相比較而言，通過向發(fā)酵體系中直接添加高產(chǎn)纖維素酶菌系能持久穩(wěn)定的降解纖維素，并可能與原發(fā)酵體系中的菌群形成物質(zhì)能量代謝平衡，以期獲得針對纖維素原料一類物質(zhì)的高產(chǎn)氣量發(fā)酵體系。并且厭氧干發(fā)酵是一種高效、環(huán)保，且對設(shè)備要求相對較低的處理方式。本試驗(yàn)通過將玉米秸稈和牛糞按照一定比例混合進(jìn)行厭氧干發(fā)酵，希望通過添加篩選得到的高效產(chǎn)纖維素酶復(fù)合菌系，從而能高效利用原料中的纖維素產(chǎn)沼氣，緩解當(dāng)前環(huán)境污染并且解決當(dāng)前能源危機(jī)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛糞收集自云南省昆明市附近養(yǎng)殖場，新鮮牛糞用保鮮袋封口備用；秸稈購于江蘇東海某農(nóng)產(chǎn)品生加工廠，粉碎長度在0.5 cm左右；纖維素菌株分離來源于河南牧田生物科技公司和農(nóng)富康公司；接種物取自昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與能源工程研究室的活性污泥。具體原料特性見表1。試驗(yàn)于2020年7—12月在中科院微生物研究所進(jìn)行。

表1 原料特性

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，Tryptone 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15.0～20.0 g/L。

LB(Luria-Bertani)培 養(yǎng) 基 ：NaCl 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，Tryptone 10 g/L。固體培養(yǎng)基需要加瓊脂15.0～20.0 g/L。

1.3 試驗(yàn)裝置

批量發(fā)酵試驗(yàn)裝置為本實(shí)驗(yàn)室自制沼氣發(fā)酵裝置，具體裝置如圖1所示。主要分為發(fā)酵裝置和和集氣裝置組成。發(fā)酵裝置是由500 mL塑料瓶組成，瓶口連接一個放氣閥和一個導(dǎo)氣管，導(dǎo)氣管連至集氣裝置。儲氣采用排水集氣法，儲氣瓶外側(cè)粘有經(jīng)過標(biāo)定的刻度線，用作讀取產(chǎn)氣量。

圖1 批量試驗(yàn)裝置示意圖

1.4 試驗(yàn)方案

1.4.1 產(chǎn)纖維素酶菌種篩選 將所購的產(chǎn)纖維素酶菌樣按照固液比1:10加入無菌蒸餾水，放置于30℃恒溫?fù)u床200 r/min搖勻2 h制成菌懸液。將菌懸液梯度稀釋涂布至CMC-Na初篩培養(yǎng)基，菌株長出后重新再初篩培養(yǎng)基上劃線純化。將單菌落按照兩點(diǎn)法接入CMCNa培養(yǎng)基，利用剛果紅浸染法對初篩的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)透明圈大小選擇高產(chǎn)纖維素酶菌株構(gòu)建復(fù)合菌系。對篩得的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，利用引物27F和1492R擴(kuò)增16rDNA。PCR產(chǎn)物送測序公司測序，再與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(www.ezbiocloud.net)進(jìn)行比對，初步鑒定菌株。

1.4.2 復(fù)合菌系構(gòu)建 參考前人的試驗(yàn)方案[15]，首先將菌株接入LB液體培養(yǎng)基，選取一株菌涂滿LB固體培養(yǎng)基，其余菌株用濾紙片浸潤后按照圖2的示意圖貼于固體培養(yǎng)基表面。選擇生長互不影響的菌株構(gòu)建成復(fù)合菌系。

圖2 拮抗試驗(yàn)示意圖

1.4.3 發(fā)酵試驗(yàn) 本試驗(yàn)總發(fā)酵體系為200 g，總發(fā)酵固體物含量(TS)為20%，接種物含量為30%，用沼液補(bǔ)足質(zhì)量。復(fù)合菌系中的菌株按照1:1的比例，總發(fā)酵體系1%的比例接入發(fā)酵體系。本次試驗(yàn)設(shè)置2個不加復(fù)合菌系的對照組和不添加發(fā)酵原料的空白組。具體物料添加表見表2。發(fā)酵溫度在沼氣發(fā)酵能正常產(chǎn)氣的前提下，按照復(fù)合菌系正常的生長溫度設(shè)定，故本次發(fā)酵溫度設(shè)定為37±1℃。測定發(fā)酵啟動前和發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵體系的TS、揮發(fā)性固體(VS)和pH，過程中測定每日沼氣產(chǎn)量，甲烷比例。由于發(fā)酵總固體物含量較高，每日兩次搖勻發(fā)酵瓶。由于空白組產(chǎn)氣極少，實(shí)際計(jì)算中未考慮其產(chǎn)氣量。

表2 發(fā)酵物料配制

1.5 測定指標(biāo)及方法

物料的TS和VS的測定參考文獻(xiàn)[16]；pH的測定使用pHS-3C酸度計(jì)測量；產(chǎn)氣量根據(jù)儲氣罐上的之前標(biāo)定的刻度確定；甲烷測定使用島津GC-14B氣相色譜測定，檢測條件為柱溫50℃，進(jìn)樣口溫度為80℃，檢測器溫度為130℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解纖維素菌株篩選

初篩純化后獲得18株降解纖維素菌株，具體菌株編號見圖3。根據(jù)剛果紅浸染CMC-Na培養(yǎng)基后通過透明圈的大小確定6株具有較高纖維素降解能力的菌株，然后通過分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定，復(fù)篩的培養(yǎng)基圖如圖4所示，具體的6株菌株編號和鑒定結(jié)果見表3。

表3 菌株編號及其鑒定結(jié)果

圖3 降解纖維素菌株初篩

2.2 復(fù)合菌系構(gòu)建

根據(jù)篩選到的6株菌按照圖2的方式進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，可以看出(ZC-1,NF-4)，(NF-3,NF-4)，(ZC-3,NF-4)，(NF-3,YJ-2)，(NF-3,YJ-5)，(NF-4,YJ-2)等菌株組合之間是沒有拮抗作用的，結(jié)合圖4中透明圈大小的結(jié)果，選擇(NF-3,NF-4)組合作為復(fù)合菌系。

圖4 降解纖維素菌株復(fù)篩

表4 菌株之間拮抗結(jié)果

2.3 復(fù)合菌系的添加對產(chǎn)氣量的影響

每日測得的沼氣量取平均值作折線圖，每日的沼氣量累計(jì)作折線圖，如圖5所示。可以看出不加復(fù)合菌系的對照組和添加復(fù)合菌系的試驗(yàn)組前期日產(chǎn)氣量曲線基本類似，發(fā)酵第一天產(chǎn)氣量達(dá)到頂峰后迅速下降。但是發(fā)酵中期對照組產(chǎn)氣量緩慢上升，在發(fā)酵第13天達(dá)到最大值，然后緩慢下降至發(fā)酵結(jié)束。而試驗(yàn)組在前期達(dá)到頂峰后產(chǎn)氣降為0 mL。試驗(yàn)組發(fā)酵中后期產(chǎn)氣量一直穩(wěn)定在100 mL左右。

圖5 日產(chǎn)沼氣量和累計(jì)沼氣產(chǎn)量折線圖

日產(chǎn)甲烷量和累計(jì)甲烷產(chǎn)量如圖6所示。試驗(yàn)組和對照組前期產(chǎn)甲烷曲線類似，發(fā)酵中期對照組出現(xiàn)產(chǎn)甲烷高峰，最高日產(chǎn)甲烷量達(dá)到72.8 mL，之后逐漸回落。而試驗(yàn)組在發(fā)酵周期前半段甲烷產(chǎn)量低于對照組，待對照組進(jìn)入發(fā)酵后期，試驗(yàn)組日產(chǎn)甲烷量才穩(wěn)步提高，在第19天日產(chǎn)甲烷量達(dá)到高峰，為70.2 mL。

圖6 日產(chǎn)甲烷量和累計(jì)甲烷產(chǎn)量折線圖

對照組和試驗(yàn)組的發(fā)酵周期分別為20天和28天，總產(chǎn)氣量分別為2.4 L和3.0 L，累計(jì)甲烷產(chǎn)量分別為543.7 mL和845.1 mL。添加復(fù)合菌系使產(chǎn)氣量提高了25%，甲烷產(chǎn)量提高了55%。

2.4 復(fù)合菌系的添加對產(chǎn)氣率的影響

產(chǎn)氣率一般能體現(xiàn)物料作為發(fā)酵產(chǎn)氣的好壞標(biāo)準(zhǔn)之一，而池容產(chǎn)氣率能體現(xiàn)發(fā)酵池綜合產(chǎn)氣效率。計(jì)算對照組和試驗(yàn)組的原料產(chǎn)氣率和平均池容產(chǎn)氣率繪制柱狀圖（圖7）的分析可知，試驗(yàn)組的原料產(chǎn)氣率分別為86.4 mL/gTS和111.4 mL/gVS均比對照組提高了21.3%，而平均池容產(chǎn)氣率略低于對照組，降低了14%。

圖7 產(chǎn)氣率和平均池容產(chǎn)氣率柱狀圖

3 討論

3.1 研究的優(yōu)缺點(diǎn)及優(yōu)化方向

纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分之一，為了對其進(jìn)行資源化利用，首先就要解決其轉(zhuǎn)化成可溶性糖的效率，而其被木質(zhì)素和半纖維素包裹而難以分離是主要的難點(diǎn)之一[22-25]。木質(zhì)素和半纖維素結(jié)構(gòu)沒有纖維素結(jié)構(gòu)那樣具有單一單體以單一形式的化學(xué)鍵連接排列的規(guī)律結(jié)構(gòu)，所以使用化學(xué)法和物理法對其破壞遠(yuǎn)比生物法效率高[26-27]。趙晨等[28]詳細(xì)對比各種預(yù)處理方案，總結(jié)出NaOH預(yù)處理從效果和成本考慮均是最佳，預(yù)處理7天使得原料產(chǎn)氣率達(dá)到225 mL/gVS，產(chǎn)氣量提高450%。而本試驗(yàn)在最優(yōu)條件下的原料產(chǎn)氣率也僅有111 mL/gVS，雖然高于對照組，但低于一般以餐廚廢棄物或綠色植物等為發(fā)酵原料的產(chǎn)氣率，這也可能與原料實(shí)際特性和干發(fā)酵的特點(diǎn)所致[17-19]?；诖舜卧囼?yàn)方式為干發(fā)酵，對空間利用率一般會高于正常的濕式發(fā)酵，由于本實(shí)驗(yàn)原料為難以發(fā)酵的纖維素類原料，所以綜合來看，平均池容產(chǎn)氣率基本與一般文獻(xiàn)報道的結(jié)果類似[20-21]。從結(jié)果來看不論是以什么方式進(jìn)行預(yù)處理，對厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣性能均有一定的促進(jìn)作用，如果考慮成本、對環(huán)境的影響、對下游的處理成本等因素來考慮，很多預(yù)處理方式差強(qiáng)人意。生物法相對于化學(xué)法而言的優(yōu)勢體現(xiàn)在對環(huán)境友好，對設(shè)備要求低。對廢棄物的處理若是以犧牲環(huán)境為代價便得不償失。

生物法預(yù)處理主要是利用降解纖維素菌株產(chǎn)的纖維素酶預(yù)處理或者與化學(xué)法等其他手段耦聯(lián)預(yù)處理原料，再進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣。趙肖玲[29]詳細(xì)對比了酶法預(yù)處理、菌液預(yù)處理、不同酶不同比例和兩種方法混合預(yù)處理對秸稈發(fā)酵產(chǎn)沼氣的性能的影響，結(jié)果得到混合酶預(yù)處理效果優(yōu)于菌液預(yù)處理，而兩種方法混合預(yù)處理優(yōu)于單一方法預(yù)處理的結(jié)論。這種酶法預(yù)處理僅將纖維素降解為可溶性糖，實(shí)質(zhì)與可溶性糖類原料發(fā)酵無異。而本試驗(yàn)擬解決的主要問題是希望通過篩選出高效降解纖維素類原料的菌株構(gòu)成復(fù)合菌系，利用篩選得到的復(fù)合菌系添加至發(fā)酵體系，希望能夠與原發(fā)酵體系中的發(fā)酵菌群達(dá)到共生體系。利用產(chǎn)纖維素素酶類添加至發(fā)酵體系，不僅對原料進(jìn)行降解，而且參與到厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣循環(huán)中，相當(dāng)于增加了發(fā)酵三階段中的第一階段途徑，使得物質(zhì)能量之間代謝循環(huán)得以增強(qiáng)。與前人對比發(fā)現(xiàn)，未來所要解決的是如何縮短發(fā)酵周期，提升產(chǎn)氣效率。其中一個方向是如何篩選到更適合發(fā)酵體系的復(fù)合菌系，復(fù)合菌系比單一菌株更能適應(yīng)環(huán)境，更能提供多種不同的組合酶[30]。另一個方向是對接種物的馴化，利用原料馴化復(fù)合菌系使之更適應(yīng)原料，從而來提高產(chǎn)沼氣性能。朱繼英等[31]和席江等[32]給出不同的觀點(diǎn)，但都提出利用原料馴化接種物對菌群結(jié)構(gòu)有影響的結(jié)論。

3.2 研究的意義

21世紀(jì)以后，眾多以高科技為核心的清潔能源如核能、太陽能、海洋能等在科技的帶動下如雨后春筍般發(fā)展，尤其是政府成功的結(jié)合某些貧困地區(qū)的特點(diǎn)而提出的光伏脫貧模式，這為太陽能產(chǎn)業(yè)錦上添花[33-34]。近年來沼氣行業(yè)似乎成為“夕陽產(chǎn)業(yè)”，大中型沼氣項(xiàng)目原料來源不穩(wěn)定，中小型項(xiàng)目效益低下，沼氣下游能源轉(zhuǎn)換技術(shù)不成熟，沒有政策扶持等一系列問題擺在從業(yè)者面前[35-36]。正如前文所提到的，厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣不僅能解決能源短缺，另一個重要的方向是解決廢棄物處理問題，從而帶動農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的健康循環(huán)發(fā)展。如今隨著農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的機(jī)械化自動化的普及，在原料的獲取上越來越有利，如何將這些資源有效利用，并以環(huán)境治理為特色是今后科研工作者要解決的重要難題。

4 結(jié)論

試驗(yàn)經(jīng)過初篩得到18株能夠降解纖維素的菌株，經(jīng)過剛果紅浸染復(fù)篩得到6株具有較高纖維素降解能力的菌株。根據(jù)拮抗試驗(yàn)篩選到最佳的復(fù)合菌系組合為 (Bacillus siamensis, Bacillus subtilis subsp.Stercoris)，該復(fù)合菌系能共存且二者產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)。厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)中，復(fù)合菌系的添加主要影響發(fā)酵中后期的產(chǎn)氣，能夠明顯提高沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量，對原料的產(chǎn)氣率也有一定促進(jìn)作用，但是延長了發(fā)酵周期，降低了平均池容產(chǎn)氣率。