陳靜寧 許靜蕓 羅曉薇 張?jiān)?吳盛桂 宮國良★

作者單位：1.汕頭市金平區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東，汕頭515044

2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣東，汕頭515044

3.汕頭潮南民生醫(yī)院病理科，廣東，汕頭515044

胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是最常見的產(chǎn)科疾病之一，臨床上分為早產(chǎn)PROM（preterm premature rupture of membranes，PPROM）和足月PROM（Term premature rupture of membranes，TPROM）。PROM 是早產(chǎn)的主要原因，會引起各種并發(fā)癥，其中不乏胎兒死亡等嚴(yán)重情況［1?2］。對PROM 的機(jī)制研究，一直是臨床熱點(diǎn)，盡管已經(jīng)提出了各種潛在的機(jī)制，但其確切的機(jī)制尚不清楚，最新的研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithe?lial?mesenchymal transition，EMT）在胎膜早破的發(fā)生中有密切聯(lián)系，EMT 參與了PROM，并且發(fā)揮了重要作用［3?4］。在以往的研究中，大多選用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者蛋白質(zhì)印跡等方法檢測胎膜中EMT的標(biāo)志物的表達(dá)情況［5］，而對于胎盤羊膜上皮細(xì)胞中EMT 的標(biāo)志物的免疫組化檢測研究且較少，本文將探討EMT 標(biāo)志物在PROM 中的表達(dá)情況，闡述EMT 在胎膜早破中的作用機(jī)制，旨在為PROM的預(yù)測、診斷及治療及提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 一般材料

選取本院2017年1月1日至2020年12月31日產(chǎn)科因PROM 而住院的患者，經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)共收集PROM 患者胎盤221 例，其中TPROM 143 例，年齡（25.97±4.48）歲，孕周（39.13±1.32）周；PPROM 78 例，年齡（26.87±5.52）歲，孕周（33.31±2.53）周；并收集同一時間段正常產(chǎn)胎盤51 例作為對照組，年齡（26.12±5.03）歲，孕周（39.31±1.41）周。所有患者均同意將胎盤送至病理科檢查及參與科學(xué)研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：PROM 納入標(biāo)準(zhǔn)包括診斷為PROM，且妊娠大于26 周的患者，并有完整的病例信息記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除多胎妊娠、畸形、試管嬰兒及妊娠期常見疾病，如妊娠期糖尿病和先兆子癇，以及明確的產(chǎn)婦及胎兒感染。

1.2 方法

1.2.1 患者的基本臨床信息

收集的病例均以胎膜早破為第一診斷入院，采集的臨床數(shù)據(jù)均為入院后第一次記錄或檢查結(jié)果，包括產(chǎn)婦年齡、孕產(chǎn)次、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白濃度、凝血酶原時間、總蛋白量、白蛋白量、球蛋白量、白/球比例信息。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及評估

標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及染色。E?Cadherin 單克隆抗體（克隆號：MX020，稀釋度1∶100）、Vimentin 單克隆抗體（克隆號：MX034，稀釋度1∶100）均購自中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；MMP9 單克隆抗體（克隆號：56?2A4，稀釋度1∶300）、TIMP1 單克隆抗體（克隆號：EPR18352，稀釋度1∶300）均購自英國Abcam 公司。免疫組織化學(xué)采用深圳達(dá)盟生物科技有限公司全自動免疫組化染色系統(tǒng)，機(jī)器型號為AS300。由胎膜破裂位置開始在歐林巴斯B51 顯微鏡下觀察，由兩位病理醫(yī)生進(jìn)行免疫組化評分。參考免疫反應(yīng)評分（IRS）［6］，結(jié)果以染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比表示，在染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的基礎(chǔ)上進(jìn)行評估免疫組化指標(biāo)。其中E?Cadherin、MMP9、TIMP1 基本所用的病例均出現(xiàn)不同程度的陽性表達(dá)，因此分類上采用強(qiáng)表達(dá)和弱表達(dá)來表示，Vimentin 出現(xiàn)部分陰性表達(dá)病例，采用強(qiáng)表達(dá)、弱表達(dá)、陰性三分類。由于部分病例出現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞脫落，因此，免疫組化只染色能夠完整顯示羊膜上皮細(xì)胞的病例。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，多組事后兩兩比較使用FDR 校正P值；計量資料以（）表示；使用Shap?iro?Wilk 檢驗(yàn)是否服從正態(tài)分布；服從正態(tài)分布的，使用Levene 檢驗(yàn)是否方差相等。方差相等的，使用方差分析。當(dāng)方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的，使用SNK 檢驗(yàn)事后兩兩比較；方差不相等的，或不服從正態(tài)分布的，使用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)。當(dāng)Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的，使用Nemenyi 檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較。E?cadherin、vimentin、MMP9、TIMP1 組間比較采用方差分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組基本資料比較

在孕、產(chǎn)次上比較，對照組>PPROM 組>TPROM 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3 組間年齡、白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白值、血小板計數(shù)、凝血酶時間、白蛋白、球蛋白指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 胎膜早破組與對照組基本資料比較［M（Q1?Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1?Q3），（±s）］

表1 胎膜早破組與對照組基本資料比較［M（Q1?Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1?Q3），（±s）］

注：組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，aP<0.05；b 為方差分析得到P 值，其他均為Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)得到P 值。

項(xiàng)目年齡白細(xì)胞中性粒單核細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白血小板凝血酶原時間總蛋白白蛋白球蛋白白球比例孕次產(chǎn)次n n n 51 51 51 51 51 51 51 50 51 51 51 51 51 51足月對照26.00（22.00～30.00）10.08（8.31～12.63）6.98（5.71～9.43）0.64（0.54～0.86）4.03（3.68～4.16）112.76±16.21 212.00（178.50～250.50）9.50（9.12～9.80）62.80（59.85～66.20）33.20（31.65～35.10）29.60（28.00～31.25）1.12（1.06～1.23）2.00（1.00～3.00）2.00（1.00～2.00）78 78 78 78 78 78 78 71 73 73 73 73 78 78 PPROM 組26.00（23.25～30.00）10.55（9.28～13.73）7.33（6.04～9.96）0.78（0.62～0.99）3.79（3.56～4.08）109.85±12.44 218.50（194.00～256.75）9.70（9.38～10.12）61.60（58.90～65.30）33.40（31.40～35.40）28.10（26.00～30.40）1.17（1.05～1.34）2.00（1.00～2.00）2.00（1.00～2.00）143 143 143 143 143 143 143 130 143 143 143 142 143 143 TPROM 組26.00（23.00～28.00）10.54（8.91～12.70）7.00（5.90～9.26）0.70（0.52～0.90）3.88（3.61～4.12）109.10±16.38 230.50（172.50～271.75）9.60（9.20～10.00）61.95（59.60～64.40）33.10（31.50～34.70）29.40（26.60～31.08）1.14（1.04～1.29）1.00（1.00～2.00）1.00（1.00～2.00）統(tǒng)計量1.319 2.515 1.674 7.068 5.429 1.075 1.676 3.360 1.793 0.959 3.909 3.069 8.896 13.482 P 值0.517 0.284 0.433 0.029 0.066 0.343b 0.433 0.186 0.408 0.619 0.142 0.216 0.012 0.001

2.2 EMT 標(biāo)志物在胎膜早破患者胎盤羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

E?cadherin 在各組中均出現(xiàn)陽性表達(dá)，并且以強(qiáng)陽性為主，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Vimentin 在3 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MMP9 和TIMP1 在各組間表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖1。

表2 EMT 標(biāo)志物在胎盤羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況［n（%）］Table 2 Expression of EMT markers in placental amniotic epithelial cells［n（%）］

圖1 Vimentin、MMP9、TIMP1 在胎膜早破患者胎盤羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）Figure 1 Expression of Vimentin，MMP9 and TIMP1 in placental amniotic epithelial cells of patients with premature rupture of membranes（SP，×400）

3 討論

羊膜表面為上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞下為致密的胚外中胚層，含較多的肌纖維母細(xì)胞。肌纖維母細(xì)胞能夠產(chǎn)生膠原纖維，因此保持足夠數(shù)量的肌纖維母細(xì)胞是保障羊膜強(qiáng)度的關(guān)鍵因素。目前的研究認(rèn)為，肌纖維母細(xì)胞的來源有以下幾種方式：間質(zhì)固有肌纖維母細(xì)胞活化；循環(huán)中來源于骨髓的纖維母細(xì)胞遷入；除了這兩種主要來源外，上皮細(xì)胞可以通過EMT 轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，參與組織纖維化修復(fù)以補(bǔ)充肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量，來維持生理功能的穩(wěn)定，EMT 是指上皮細(xì)胞在特定的條件下發(fā)生程序性轉(zhuǎn)化，經(jīng)過細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間葉細(xì)胞的過程。EMT 不僅存在胚胎發(fā)育過程中，同時還參與了組織再生、器官纖維化以及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等過程，從組織的修復(fù)理論上來說，EMT 參與胎膜早破的過程也是合理的［7］。

大部分理論認(rèn)為，PROM 由多個因素引起，炎癥、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等均參與其中［8?9］，而EMT 與PROM 的關(guān)系研究是近幾年才出現(xiàn)的，理論體系尚不十分完整。對于EMT 的研究，首先是選取標(biāo)志物，不同研究文獻(xiàn)中選用的標(biāo)志物大同小異［10］，本研究選用比較常見的、意義明確的EMT 標(biāo)志物，分別為：E?cad?herin、Vimentin、MMP9、TIMP1。E?Cadherin 是主要的EMT 標(biāo)志物，其減少或丟失是EMT 的標(biāo)志性改變。有關(guān)EMT 和PROM 的研究文獻(xiàn)中，大多數(shù)都會選取該指標(biāo)，但研究方法很少采用免疫組化法，本研究結(jié)果這體現(xiàn)出免疫組化的弊端，免疫組化是最好的定性指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于臨床和科研中，但其沒有精確定量的功能。因此，在免疫組化水平，E?Cadherin 無法應(yīng)用于EMT 與PROM 關(guān)系研究。研究中Vimentin，MMP9，TIMP1 均出現(xiàn)差異性表達(dá)，針對于胎膜早破的EMT 機(jī)制研究，這3 個指標(biāo)在免疫組化水平可以應(yīng)用。Vimentin、MMP9、TIMP1 均為常用的EMT 標(biāo)志物，其中以Vimentin意義最為突出，Vimentin 是最典型的間葉細(xì)胞標(biāo)志物，Vimentin 在羊膜上皮細(xì)胞中出現(xiàn)陽性表達(dá)，代表著羊膜上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一EMT 過程。MMP9 和TIMP1 在各組間表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究和文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［11?12］。

有關(guān)PROM 與EMT 的研究并不多，最有代表性的是Haruta Mogami 分別于2017年和2018年在同一期刊發(fā)表的兩篇論著［3?4］，對EMT 在胎膜早破中的作用進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，小破裂引起細(xì)胞因子的瞬時上調(diào)，而大破裂引起胎膜中促炎細(xì)胞因子的持續(xù)上調(diào)。來自羊膜的胎兒巨噬細(xì)胞被募集到破裂的羊膜中，其中巨噬細(xì)胞粘附分子被高度表達(dá)。招募的巨噬細(xì)胞釋放IL?1β 和TNF，促進(jìn)EMT 和上皮細(xì)胞遷移。該研究為EMT 在PROM 中的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Carla Janzen 于2017年發(fā)表了題目為《The Role of Epithelial to Mesenchymal Tran?sition in Human Amniotic Membrane Rupture》的論著［5］，通過對人類胎膜和羊膜上皮細(xì)胞的研究，提出在PPROM 的羊膜中，EMT 作用增強(qiáng)，研究從免疫組化角度證實(shí)了這一理論。希望通過新的理論，能夠提出針對EMT 的治療手段，達(dá)到預(yù)防和治療胎膜早破這一產(chǎn)科常見疾病的目的。

綜上所述，EMT 參與了PROM 的發(fā)病過程，免疫組化方法檢測vimentin、MMP9、TIMP1 在羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)可以作為其發(fā)生EMT 標(biāo)志物，在臨床工作中，通過干預(yù)EMT 這一病理過程，有望成為治療胎膜早破的一個新思路。