汪元亮，熊馬劍，左軍鳳，朱碧君

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

藥用膠塞是藥品包裝中常用于密封的組件，其具有優(yōu)異的密封性、化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)［1］。藥用膠塞常用的硫化體系使用硫或含硫化合物作為交聯(lián)劑，硫化過程中交聯(lián)劑難以反應(yīng)完全，過量的硫或含硫化合物會(huì)產(chǎn)生游離硫，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致膠塞出現(xiàn)“噴霜”現(xiàn)象［2-3］，對(duì)膠塞的性能有不利的影響。在后續(xù)的使用過程中，具有游離硫的膠塞與金屬物品接觸時(shí)會(huì)與金屬反應(yīng)，污染藥品［4］。膠塞中游離硫含量也作為評(píng)價(jià)膠塞配方或硫化程度的指標(biāo)［5］，因此膠塞中游離硫的含量測(cè)定具有重要意義。

2015 年版《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》中“揮發(fā)性硫化物測(cè)定法”（YBB00302004-2015）采用的硫斑法僅為限量考察［6］，準(zhǔn)確度稍差。揮發(fā)性硫化物的測(cè)定有不同的方法［7-15］，游離硫遇酸即可生成揮發(fā)性的硫化氫，游離硫的測(cè)定也是揮發(fā)性硫化物測(cè)定的一種方法。國(guó)標(biāo)中游離硫的測(cè)定方法有GB/T 3516-2006，其中包括亞硫酸鈉法、銅螺旋法［16］，這兩種方法操作過程煩瑣、靈敏度和平行性均不理想。國(guó)內(nèi)部分學(xué)者對(duì)游離硫提出了不同的測(cè)定方法［3，17-20］，均有各自的特點(diǎn)，但是對(duì)游離硫測(cè)定所涉及的膠塞均比較單一。本研究?jī)?nèi)容建立了高效液相法測(cè)定橡膠中游離硫的含量，測(cè)定樣品涉及二十種不同種類的藥用膠塞，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與儀器

1.1 試劑試藥

升華硫（LOT：20200109，國(guó)藥）；二硫化四乙基秋蘭姆（CCAD300202，美國(guó)CATO）、一硫化四甲基秋蘭姆（C10083427，上海麥克林）、四異丙基二硫化秋蘭姆（Lot：ZZS-21-S034-B1，ZZSTANDARD）、二硫化四丁基秋蘭姆（D10211，美國(guó)BPS）、二硫化四甲基秋蘭姆（CCPD100803，美國(guó)CATO）、硫化樹脂、烷基苯酚二硫化物、聚對(duì)叔丁基苯酚二硫化物(P909950，上海麥克林）、噻唑（D-10201，美國(guó)BPS）、6-（二丁基氨基）-1,3,5-三嗪-2,4-二硫醇（D462763，加拿大TRC）、促進(jìn)劑DZ（Lot：AMD-091-02,美國(guó)BPS）、促進(jìn)劑NS（10203，美國(guó)BPS）、促進(jìn)劑CZ（CCHM701218，美國(guó)CATO）、促進(jìn)劑NOBS（CCHM701837，美國(guó)CATO）。無(wú)水乙醇（國(guó)藥）、甲醇（阿拉丁）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（LC-20ADXR，日本島津公司）；電子分析天平（AL204C，梅特勒-托利多公司）。色譜柱：Shim-pack GIST C18 5 μm，4.6 mm×250 mm。

1.3 試驗(yàn)樣品

本試驗(yàn)共收到來(lái)自A 公司（3 批）、B 公司（12批）、C 公司（4 批）、D 公司（14 批）共計(jì)20 個(gè)品種33 批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，90%A；15～20 min，95%A；20～30 min，90%A）。柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照溶液的制備

對(duì)照儲(chǔ)備液：稱取升華硫?qū)φ掌芳s10 mg，加無(wú)水乙醇超聲溶解并定容至100 mL。

對(duì)照溶液：分別量取適量對(duì)照儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋至硫濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的系列對(duì)照液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品適量，總表面積為20±2 cm2，置于250 mL 圓底燒瓶中，精密加入50 mL 無(wú)水乙醇，稱重，回流6 h，補(bǔ)足重量，過濾后，供測(cè)定。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 提取溶劑的篩選取總表面積約20 cm2樣品，分別置于250 mL 圓底燒瓶中，精密加入無(wú)水乙醇、水、甲醇、丙酮各50 mL，稱定重量，回流4 h，冷至室溫后補(bǔ)足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液，照上述色譜條件測(cè)定，記錄游離硫峰面積，結(jié)果無(wú)水乙醇回流4 h，所得硫含量最高提取更完全（見表1），因此選擇無(wú)水乙醇作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑測(cè)定結(jié)果

2.4.2 提取時(shí)間的考察取總表面積約20 cm2樣品若干份，置于250 mL 圓底燒瓶中，分別精密加入50 mL 無(wú)水乙醇回流不同時(shí)間后，補(bǔ)足重量，過濾后測(cè)定，記錄游離硫峰面積，結(jié)果見圖1，根據(jù)結(jié)果選擇無(wú)水乙醇回流6 h 作為樣品提取條件。

圖1 不同提取時(shí)間的測(cè)試結(jié)果

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)量取升華硫和［二硫化四乙基秋蘭姆、一硫化四甲基秋蘭姆、四異丙基二硫化秋蘭姆、二硫化四丁基秋蘭姆、二硫化四甲基秋蘭姆、硫化樹脂、烷基苯酚二硫化物、聚對(duì)叔丁基苯酚二硫化物、噻唑、6-（二丁基氨基）-1,3,5-三嗪-2,4-二硫醇、促進(jìn)劑DZ、促進(jìn)劑NS、促進(jìn)劑CZ、促進(jìn)劑NOBS］適量，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖2～圖5）。經(jīng)對(duì)照溶液定位知：S 與其他硫化劑或促進(jìn)劑的峰分離良好，理論板數(shù)n>3 000。

圖2 游離硫與其他14種硫化劑或硫化促進(jìn)劑的色譜圖

圖3 升華硫-S對(duì)照溶液色譜圖

圖4 樣品色譜圖

圖5 空白溶劑色譜圖

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用無(wú)水乙醇稀釋至硫濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的系列對(duì)照液。按上述條件測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積（y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果線性良好，線性方程y=6.4954E-07x+0.001 4，r=0.999 9。

2.4.5 檢測(cè)限取對(duì)照品溶液適量，用無(wú)水乙醇逐步稀釋后進(jìn)樣，以信噪比約3 時(shí)作為檢測(cè)限，結(jié)果對(duì)照液檢測(cè)限濃度為0.05 μg/mL，樣品檢出限為0.125 μg/cm2。

2.4.6 定量限取對(duì)照品溶液適量，用無(wú)水乙醇逐步稀釋后進(jìn)樣，以信噪比約10 時(shí)作為定量限，結(jié)果定量限為0.375 μg/cm2。

2.4.7 溶液穩(wěn)定性取上述混合對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、48 h 進(jìn)樣10 μL，考察溶液穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照溶液在24 h 內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，按方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果精密度良好，見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 回收率試驗(yàn)取預(yù)灌封注射器用聚異戊二烯橡膠針頭護(hù)帽，計(jì)總表面積約10 cm2樣品，分別加入硫?qū)φ掌?.6、0.8、1.0 mg，混勻。照方法操作，平行3 份。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 結(jié)果

取樣品，照方法測(cè)定，結(jié)果見表5，結(jié)果顯示：33 批樣品中，有31 批樣品檢測(cè)出游離硫，其中預(yù)灌封注射器用聚異戊二烯橡膠針頭護(hù)帽檢出量最大，按面積計(jì)算為0.086 1 mg/cm2，另外有兩批未檢出。

表5 樣品中游離硫測(cè)定結(jié)果

表5 樣品中游離硫測(cè)定結(jié)果（續(xù)）

3 討論

經(jīng)對(duì)收集的20 種共33 批樣品進(jìn)行硫含量的測(cè)定，部分膠塞中游離硫的測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)大于YBB 標(biāo)準(zhǔn)中硫斑法的限值，YBB 方法與本法的樣品處理過程并不相同，YBB 前處理為121℃/30 min，而本方法采用乙醇回流6 h 提取，兩種方法所提取的硫含量并不相同，本法中提取游離硫的定義不僅包括原有的游離硫，還包括在回流過程中，S 健斷裂，新生成的游離硫，所以其測(cè)定結(jié)果值較大。通過對(duì)不同種類的膠塞的測(cè)定結(jié)果比較，硫磺系的測(cè)定結(jié)果最大，主要是硫磺體系在硫化過程中主要是形成多硫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，容易出現(xiàn)硫化還原現(xiàn)象，因此藥用膠塞體系中和藥物直接接觸的應(yīng)盡量減少硫磺體系的使用。