溫 煒，黃達錠，鮑勁霄，張增輝，2，3

（1.華東師范大學化學與分子工程學院,上海綠色化學與化工過程重點實驗室,上海分子治療與新藥開發(fā)工程研究中心,上海200062；2.上海紐約大學計算化學聯(lián)合研究中心,上海200062；3.美國紐約大學化學系,紐約10003）

程序性細胞死亡蛋白（PD-1）及其配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）是一種重要的免疫檢查點［1，2］，其在T細胞和腫瘤細胞中的表達上調(diào)可誘導免疫抑制［3，4］.其中在腫瘤細胞中的表達上調(diào)就是癌細胞免疫逃逸的機制［5～7］.基于阻斷PD-1/PD-L1的單克隆抗體（mAb）免疫療法顯示出其能恢復病人的抗腫瘤免疫應答的作用［3，8，9］.最近，2種靶向PD-1的單克隆抗體（Pembrolizumab和Nivolumab）已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于治療黑色素瘤、非小細胞肺癌和頸部鱗狀細胞癌［10］.這些單抗在多發(fā)性腫瘤的臨床應用中具有顯著的腫瘤活性抑制作用［11～14］.

雖然PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab的晶體結構已經(jīng)分別由Lee等［15］和Tan等［16］確定，但是，關于有助于設計基于結構的單抗或小分子抑制劑的PD-1熱點的詳細信息仍然不清楚.因此，全面分析和了解這些單抗與PD-1的結合機制非常重要.再結合最近研究的PD-1與PD-L1在殘基水平上的結合機制［17］，將有助于下一代單抗的開發(fā)［18，19］.

本文利用分子動力學研究了2個單抗（Pembrolizumab和Nivolumab）與PD-1結合的機制.使用計算丙氨酸掃描方法識別了PD-1/mAb復合物中的結合熱點，對mAb和PD-1的結合熱點進行了預測，并對兩個體系熱點的異同進行了分析和討論.

1 實驗部分

1.1 分子動力學模擬

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）［20］中下載了人源PD-1與抗體復合物（Pembrolizumab和Nivolumab）的2種晶體結構，其PDB編碼分別為5GGS［15］和5WT9［16］.用SWISS-MODEL服務器［21］對5GGS（PD-1上的殘基25～30）和5WT9（PD-1上的殘基85～93和重鏈上的殘基128～133）中的缺失殘基進行建模補全.所有動力學模擬均用AMBER14軟件包［21］中的tleap模塊對復合物進行氫原子的添加［22］.Na+和Cl-被溶解在TIP3P水盒中以保持電中性，離子和蛋白的緩沖距離為1.2 nm［22，23］.溶劑化后的系統(tǒng)用AMBER的ff14SB力場進行立場參數(shù)設置［23，24］.為了消除邊界效應，采用周期邊界條件（PBC）.采用Particle Mesh Ewald（PME）處理長距離靜電相互作用，非鍵相互作用的截距為1 nm［25］.步長時間設置為2 fs，用SHAKE約束包含氫原子的共價鍵［26］.溫度由Langevin恒溫器控制，碰撞頻率5.0 ps-1，壓力由Berendsen氣壓表控制至1.01325×105Pa［27～30］.

在能量最小化過程中，首先用2.09 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)約束除氫原子以外的蛋白質(zhì)復合物，然后用0.42 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)約束復合物骨架，最后不用任何約束對整個體系進行優(yōu)化.在加熱步驟中，將每個系統(tǒng)從0 K加熱到300 K，并以0.42 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)限制在蛋白質(zhì)主鏈原子上200 ps，300 K下在恒溫恒容（NVT）和恒溫恒壓（NPT）系綜中平衡22 ns.對蛋白質(zhì)骨架重原子的均方根偏差（RMSD）進行了監(jiān)測，使其在平衡階段達到穩(wěn)定狀態(tài).最后，進行了5次獨立的22 ns動力學采樣（軌跡），總模擬時間為110 ns，并選擇最后2 ns軌跡進行能量分析.

1.2 MM/GBSA-IE-AS計算

對于每個復合物體系，丙氨酸掃描計算法［30～33］都用來計算殘基特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合自由能.本文掃描0.6 nm內(nèi)的分子間殘基對并將其突變?yōu)楸彼嵋杂嬎鉖D-1/mAb復合物的野生型和突變型之間的結合自由能差在這項工作中，丙氨酸掃描（MM/GB/ASIE）方法［17，30～33］被用來計算單個殘基對PD-1/mAb結合的自由能貢獻.利用這種方法，相對結合自由能可以計算為

式中：A和B分別代表配體和受體；a和x分別代表突變后的丙氨酸和突變前的殘基，殘基的氣相自由能貢獻被近似處理成突變后殘基和配體的氣相結合能與野生型的殘基與配體的氣相結合能之差.在分子力學廣義波恩表面積（MM/GBSA）方法［21］中，氣相相互作用能定義為分子力相互作用焓和熵貢獻之和，其中野生型的殘基與配體之間的能量按下式計算［31］：

類似的，突變后的殘基與配體之間的能量為

式中：γ和β值分別為2.26556 kJ·mol-1·nm-2和3.8456 kJ/mol的標準值［34］.

對于每個PD-1/mAb復合物，運行5條MD軌跡，最終能量計算的結果是在5條獨立軌跡上的取得的平均值ΔΔG（表1），這顯示出單個殘基對復合物結合的貢獻.計算每個殘基中的標準偏差（SD）以檢驗模擬誤差（表1）.在一條軌跡的GBSA/IE計算中，最后的2 ns軌道用于丙氨酸掃描計算.從軌跡中提取了10000幀，間隔為0.2 ps，用于MM/GB/ASIE計算.在AMBER14軟件包中實現(xiàn)的MM/PB（GB）SA方法用于MM/GBSA計算［22］.采用Yan等［32］使用的介電常數(shù)值，即非極性殘基為1，極性殘基為3，帶電殘基為5.在丙氨酸掃描法計算很多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用中，計算的范德華能量通常比實驗數(shù)據(jù)高.因此，將芳香環(huán)殘基的氫原子和碳原子的經(jīng)驗常數(shù)ε調(diào)整為AMBER14中PHE值的75%，TYP值的30%，TRY值的45%.MM/GB/ASIE計算的其它詳細參數(shù)設置與文獻［32］中相同.

Table 1 Computational alanine scanning result for the PD-1/pembrolizumab system

2 結果與討論

2.1 結合復合物的動力學穩(wěn)定性

通過原子位置的RMSD來測量PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab的5個系統(tǒng)的動態(tài)穩(wěn)定性分別如圖1（A）和（B）所示.彩色線表示骨架中所有重原子（非氫原子）相對于初始晶體結構的RMSD與模擬時間的函數(shù)關系.結果表明，復雜體系是穩(wěn)定的，可用于計算丙氨酸掃描和其它分析.

Fig.1 RMSDs of the heavy atoms in backbone of the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)complexes relative to the initial crystal structures

計算并繪制了PD-1/mAb體系中殘基的均方根波動（RMSF），結果如圖2所示.5WT9中PD-1缺失的殘基85～93是PD-1/Nivolumab體系中最靈活的區(qū)域［圖2（B1）］，這些殘基在晶體結構中沒有確定坐標，是由SWISS-MODEL服務器模擬的.對于配合物中的PD-1，2種PD1/mAb體系中共有的最靈活的區(qū)域是殘基71～74所在的loop區(qū)域［圖2（A1）和（B1）］.

Fig.2 RMSFs of the Cαatoms calculated from the 22 ns trajectory of PD-1/pembrolizumab(A1—A3)and PD-1/nivolumab(B1—B3)trajectories

因此，用SWISS-MODEL服務器模擬的PD-1/mAb復合物結構（5GGS和5WT9）在MD模擬過程中是穩(wěn)定的，軌跡用于進一步分析是可靠的.

2.2 PD-1上預測到的熱點殘基

MM/GB/ASIE法［31，32］用于計算2個體系（PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab）的殘基特異結合能貢獻，這2個體系在丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)實驗值均不可用.在PD-1/Nivolumab復合物中，雖然Tan等［16］測量了4個N-連接糖基化位點（PD-1N49，PD-1N58，PD-1N74和PD-1N116）的實驗數(shù)據(jù)，但PD-1在晶體結構中僅呈現(xiàn)出PD-1N58位點的糖基化信息，而在表面等離子共振（SPR）分析（用于測丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)）中包含4個糖基化位點，由于糖基化量的不同，SPR測到的丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)換算成的實驗數(shù)據(jù)，不適合與只有1個糖基化位點的MM/GB/ASIE計算結果進行比較.圖3（A）繪制了2個系統(tǒng)中PD-1的預測結果以用于對比.在2個系統(tǒng)中任意一個被預測為熱點的PD-1上的殘基被列在圖3（A）中.共發(fā)現(xiàn)了9個此類殘基，并將它們對結合配合物的相對能量貢獻進行了比較.

Fig.3 Hot spots predicted on PD-1 in two PD-1/mAb systems compared and arranged according to the sequence of residues on PD-1(A)and the superposition diagram of two PD-1/mAb complexes(PD-1/pembrolizumab and PD-1/nivolumab)(B)

2.3 2個PD-1/mAb體系中PD-1的特定分析

2.3.1 PD-1/Pembrolizumab 如圖3（A）所示，PD-1D85是PD-1上最重要的熱點.由表1數(shù)據(jù)可知，PD-1D85的自由能貢獻主要來自靜電能（ΔΔEele）.PD-1D85和mAb-LR96之間形成強烈的靜電相互作用［圖4（A）］.第2個和第3個重要的熱點分別是PD-1R86和PD-1L128，范德華能量（ΔΔEvdW）占主導作用.

Fig.4 Details of the interaction of hotspots and warm spots at the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)interfaces

2.3.2 PD-1/Nilvolumab 對于該體系，主要的相互作用來自帶正電的PD-1K131，其與mAb-LY49形成了強烈的陽離子-π相互作用［圖4（B）］.此外，PD-1P28和PD-1P130也是重要的熱點.如表2所示，vdW相互作用在所有3個熱點中起著最重要的作用.

Table 2 Computational alanine scanning result for the PD-1/nivolumab system

綜合來看這2個體系的最重要貢獻是強疏水相互作用（圖5），特別是陽離子-π、π-π或者methionine-π相互作用.唯一的例外是PD-1D85，其是PD-1/Pembrolizumab中最重要的熱點，但PD-1D85的vdW能量為輕微的負值，靜電能是主要貢獻.這2個體系其它帶電的熱點殘基都通過陽離子-π相互作用與抗體顯示出強烈的vdW相互作用.從PD-1與單抗的結合區(qū)域來看，這兩個系統(tǒng)中的差異較大［圖3（B）］.如圖3（A）所示，2個系統(tǒng)中重疊的熱點僅有PD-1K131.此外，如圖3（A）和圖4所示，Pembrolizumab主要與PD-1上的C′sheet（殘基75～82）、C′D-loop（殘基83～94）和重疊結合壓（FG-loop）（殘基127～134）結合［圖3（B）］，這與PD-L1和PD-1的結合模式［17］相似.然而，Nivolumab從不同的方向結合PD-1，結合區(qū)域包括PD-1上的FG-loop和N-loop［殘基25～35，圖3（B）］［16］.與此同時，N-loop在PD-1/Pembrolizumb的晶體結構中大部分是缺失的（晶體結構中該區(qū)域的缺失說明該處擺動特別大，基本沒有結合位點）.因此，從Pembrolizumab和Nivolumab與PD-1結合熱點重疊少的結果可見，Pembrolizumab和Nivolumab之間存在不同的阻礙PD-1/PD-L1結合的模式，從FG-loop的角度來看，兩者之間還可能存在一定的競爭關系［16］.

Fig.5 Composition of free energy contribution for hotspots and warm spots predicted by MM/GB/ASIE method

2.4 單抗上預測的熱點殘基

因為在相互作用界面兩側進行了MM/GB/ASIE計算，所以除了分析PD-1的熱點殘基，還可以分析單抗中的關鍵殘基.如圖4和圖6所示，對于PembrolizumabHF101是主要熱點，其與PD-1K131和PD-1K78形成強烈的陽離子-π相互作用.HY33也是與PD-1K78形成陽離子-π相互作用的重要殘基.在PD-1/Nivolumab復合物中，熱點數(shù)量明顯少于Pembrolizumab上的熱點，這與PD-1/mAb系統(tǒng)中PD-1上的趨勢一致.有趣的是，Nivolumab上的熱點都是酪氨酸，Pembrolizumab上的熱點酪氨酸所占比例最多，它們都是由vdW能量占主導的（圖5）.

Fig.6 Hot and warm spots predicted on the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)

由于PD-1K131是前面對PD-1的分析中兩個體系唯一共享的熱點殘基，因此研究了與PD-1K131相互作用的單抗殘基之間的關系.如表3所示，與PD-1K131相互作用的殘基幾乎都有芳香側鏈，它們的相互作用來自穩(wěn)定的陽離子-π（PD-1K131的胺基離子與單抗的酚基）.表3中與PD-1K131結合的殘基包括4個酪氨酸殘基，它們與PD-1K131的相互作用都相似地受vdW相互作用的支配.事實上，不只是與PD-1K131結合的殘基，Pembrolizumab和Nivolumab上熱點和溫點的自由能貢獻幾乎均由vdW能量控制（圖5）.這說明提高抗體殘基的靜電相互作用的貢獻，有助于進一步優(yōu)化PD-1抗體的結合活性.

Table 3 Residues on the mAbs interacting with the only overlapping hotspots PD-1K131 and their main interaction types and the spot types of themselves

3 結 論

本文檢測了2種PD-1單克隆抗體（mAb），并利用高效的計算丙氨酸掃描方法研究了它們與PD-1的結合機制.對PD-1/mAb結合起重要作用的熱點殘基進行了定量分析.對兩種單抗與PD-1的結合方式進行了比較分析，同時對比了它們與PD-1/PD-L1結合方式的差別，發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1與Pembrolizumab的結合方式類似，與Nivolumab的結合方式差異較大.PD-1K131是2個PD-1/mAb復合物中唯一有交集的相對重要的熱點.在單抗方面，發(fā)現(xiàn)單抗與PD-1K131結合的關鍵殘基以vdW相互作用為主，這也是整個抗體中最重要的相互作用貢獻類型，本研究為設計以PD-1為靶點的新型單抗以及小分子藥物提供了重要的啟示.

感謝紐約上海和華東師范大學多功能創(chuàng)新平臺（001）為我們提供計算時長.