郭金洲 陳海寧 馬晶鑫 田維毅 蔡琨

【摘 要】 目的：研究G蛋白偶聯(lián)雌激素受體GPR30在大豆異黃酮降低ox-LDL導(dǎo)致的EA.hy926細(xì)胞氧化損傷時(shí)發(fā)揮的作用。方法：體外培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、模型組（ox-LDL）、雌二醇組（ox-LDL+E2）、大豆異黃酮組（ox-LDL+SIF）、GPR30受體拮抗劑組（G-15預(yù)先干預(yù)2 h，ox-LDL+SIF）。采用CCK-8法檢測細(xì)胞生存率，二硝基苯肼顯色法檢測LDH活性，ELISA法檢測ET-1水平，WST-1法檢測SOD活力，TBA法檢測MDA含量，qPCR檢測HO-1mRNA表達(dá)，Western Blot檢測GPR30受體蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與模型組相比，在SIF干預(yù)下，細(xì)胞存活率升高，LDH活性、ET-1水平和MDA含量均降低，SOD活力和HO-1mRNA表達(dá)升高（P<0.01），拮抗GPR30受體后，與SIF組相比，細(xì)胞存活率顯著下降，LDH活性、ET-1水平和MDA含量均顯著增高，SOD活力和HO-1mRNA表達(dá)下降（P<0.01或P<0.05），GPR30蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論：大豆異黃酮可以顯著降低ox-LDL引起的EA.hy926細(xì)胞氧化損傷，其作用機(jī)制可能與結(jié)合G蛋白偶聯(lián)雌激素受體后發(fā)揮類雌激素作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 大豆異黃酮;GPR30;ox-LDL;氧化損傷;內(nèi)皮細(xì)胞;植物雌激素

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2021）08-0017-06

Abstract：Objective To studythe role of GPR30 in soy isoflavones（SIF） on human umbilical vein cell fusion cell （EA.hy926） by oxidative damage.Methods EA.hy926 cells were cultured in vitro and oxidized low density lipoprotein （ox-LDL） was induced to form oxidative damage cell model.The cells divided randomly into control group， model group （ox-LDL）， estradiol group （ox-LDL +E2），soy isoflavonesgroup （ox-LDL +SIF）， GPR30 receptor antagonist group（G-15 pre-intervention for 2h， ox-LDL+SIF） .Cell survival rate was detected by cck-8 method， LDH activity was detected by dinitrophenylhydrazine chromography，ET-1 level was detected by ELISA method， SOD activity was detected by WST-1 method， and MDA content was detected by TBA method.mRNA expression of ho-1 was detected by qrt-pcr，protein expression of GPR30 was detected by Western Blot.Results Compared with the model group， under SIF intervention， cell survival rate was increased， LDH activity， ET-1 level and MDA content were all reduced， and SOD activity andHO-1mRNA was increased （P<0.01 ）;Compared with the SIF group，the GPR30 receptor is antagonized，cell survival rate was reduced， LDH activity， et-1 level and MDA content were all increased， and SOD activity andHO-1mRNA was reduced （P<0.01 ），protein expression of GPR30 wasreduced （P<0.01 ） Conclusion The SIFcan significantly reduce oxidative damage of EA.hy926 cells caused by ox-ldl， and the mechanism of action may be related to the GPR30receptor.

Key words：SIF;GPR30;ox-LDL;Oxidative Damage; The Endothelial Cells

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是多因素共同作用引起的疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制尚不明確。但研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]，而ROS蓄積增多引起的血管內(nèi)皮氧化損傷是 AS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER/GPR30）作為一種新型的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)雌激素膜受體[4]，在雌激素非基因組效應(yīng)中發(fā)揮主要作用[5]。有報(bào)道稱，通過調(diào)節(jié)GPR30降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[6]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮（soy isoflavones，SIF）具有良好的抗氧化損傷作用[7-8]，SIF是植物雌激素的一種，具有類雌激素作用。因此我們推測大豆異黃酮可能通過GPR30介導(dǎo)的類雌激素效應(yīng)降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。為驗(yàn)證我們的猜想，實(shí)驗(yàn)選用ox-LDL誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞構(gòu)建內(nèi)皮氧化損傷模型，使用SIF干預(yù)損傷模型，觀察其抗氧化作用，并觀察使用GPR30受體拮抗劑G-15干預(yù)后，SIF抗氧化損傷效應(yīng)的變化，進(jìn)而探討SIF抗氧化損傷及其與GPR30的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合細(xì)胞（Human umbilical vein cell fusion cell，EA.hy926），購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫（編號：KCB2014049YJ）。

1.1.2 試劑與儀器 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物有限公司; ox-LDL購自廣州奕源有限公司;RIPA裂解液購自索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑購自尚寶生物科技有限公司;ET-1Elisa試劑盒購自深圳子科;LDH檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒均購自南京建成有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自BIO-RAD公司;RNA提取試劑盒購自Thermo公司;PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH PLUS）購自Takara公司;β-actin antibody、山羊抗兔熒光Ⅱ抗購自Absin公司;GPR30 antibody購自購自CST公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀購自Therom公司;倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為：空白對照組（Control）、模型組（ox-LDL）、雌二醇組（E2）、大豆異黃酮組（SIF）、GPR30受體拮抗劑組（G-15）。模型組加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL ;雌二醇組、大豆異黃酮組在加入ox-LDL 的同時(shí)再分別給予終濃度為10 μmol·L-1E2和80 μg·L-1SIF，GPR30受體拮抗劑組預(yù)先使用10-7 mol·L-1G-15干預(yù)2 h，然后加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL和80 μg·L-1SIF，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔，接種于96孔板中，分組及處理方式參照2.1進(jìn)行，干預(yù)結(jié)束后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入90 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長測定各孔吸光值（OD）并計(jì)算細(xì)胞存活率，并按試劑說明書公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 LDH、ET-1檢測 取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞以1×106個(gè)/孔，接種于T25瓶中，按照2.1分組并處理細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，分裝于1.5 mLEP管中，于-20 ℃保存。細(xì)胞上清中LDH、ET-1檢測參照各自試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 SOD、MDA的檢測 按照2.3收集細(xì)胞培養(yǎng)上清后，使用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適當(dāng)預(yù)冷PBS于冰上使用細(xì)胞刮刀，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)存于1.5 mLEP管中，1000×g，4 ℃離心5 min，棄上清后，加入含有1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，超聲粉碎后，于冰上裂解30 min，12000×g，4 ℃離心取上清，即得細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定各組蛋白含量。SOD、MDA檢測參照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 qRT-PCR檢測 HO-1 mRNA表達(dá)水平

按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取，RNA樣品以O(shè)D260/OD280的比值在1.8～2.0之間為佳。RNA反轉(zhuǎn)錄按試劑盒進(jìn)行，cDNA保存在-20 ℃。以cDNA作為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系及條件見表1。按2-ΔΔct法計(jì)算各基因相對表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見表2。

1.2.6 Western Blot檢測GPR30蛋白表達(dá) 細(xì)胞核蛋白提取按照核蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞總蛋白提取及蛋白定量參照1.2.4進(jìn)行，蛋白上樣量統(tǒng)一為30 μg，使用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法于冰上轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗GPR30（1∶[KG-*3/5]300）β-actin（1∶[KG-*3/5]1000），4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，加入二抗（1∶[KG-*3/5]10000）室溫孵育1h，用TBST洗滌3次。采用ECL顯色，使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，當(dāng)滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞存活率的影響 模型組細(xì)胞存活率較空白組顯著下降（P<0.01）;E2和SIF干預(yù)的細(xì)胞存活率較模型組顯著增高（P<0.01），拮抗GPR30受體后，SIF干預(yù)細(xì)胞存活率與模型組相比無差異，與E2和SIF干預(yù)組相比細(xì)胞存活率顯著下降。結(jié)果見表3。

3.2 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、ET-1影響 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮組細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組，細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1水平明顯降低均有顯著性差異（P<0.01）;GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高（P<0.01）。結(jié)果如圖1所示。

3.3 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞中SOD、MDA影響 與空白組相比，模型組細(xì)胞SOD活力有顯著下降（P<0.01）MDA水平均顯著升高（P<0.01），雌二醇組和大豆異黃酮組SOD活力、MDA水平亦無顯著性差異;與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組細(xì)胞SOD活力有顯著升高（P<0.01）MDA水平均顯著下降（P<0.01）;與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組SOD活力及MDA水平無顯著性差異;GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細(xì)胞SOD活力顯著下降（P<0.01）MDA水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，SOD活力及MDA水平無顯著性差異。結(jié)果如圖2所示。

3.4 各組細(xì)胞中HO-1 mRNA表達(dá)水平 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）;與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異;GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，HO-1 mRNA表達(dá)顯著顯著下降（P<0.01）。結(jié)果見表4。

3.5 各組細(xì)胞中GPR30受體蛋白表達(dá)情況 正常組細(xì)胞中，GPR30蛋白表達(dá)較低，在ox-LDL干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)GPR30蛋白表達(dá)顯著增多，與正常組相比增多具有顯著性差異;ox-LDL分別與雌二醇和大豆異黃酮共同干預(yù)后，與正常組相比，GPR30蛋白表達(dá)顯著增多，與模型組相比，GPR30受體蛋白表達(dá)明顯降低;使用GPR30特異性阻斷劑G-15預(yù)先處理后，ox-LDL和大豆異黃酮共同干預(yù)，GPR30蛋白表達(dá)與正常組相比，無顯著差異，與大豆異黃酮組相比，顯著下降。結(jié)果如圖5所示。

4 討論

ROS氧化修飾低密度脂蛋白（LDL）生成的氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）[9]可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中g(shù)p91吞噬細(xì)胞氧化酶表達(dá)增加，使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致ROS生成增多[10]，引起血管內(nèi)皮氧化損傷并進(jìn)一步導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展。在本次實(shí)驗(yàn)中，使用ox-LDL干預(yù)EA.hy926細(xì)胞后，細(xì)胞生存率明顯下降，并出現(xiàn)了明顯的氧化損傷，證明模型制備成功。

女性絕經(jīng)后，LDL-C水平急劇上升，而HDL-C水平則適度下降。同樣，HDL-C的下降伴隨著apoA-I水平的升高，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和CAD發(fā)病率和死亡率升高，因此，有理由推測內(nèi)源性腺激素起到了重要作用[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，SIF可影響女性激素水平，其作為植物雌激素的一種，具有類雌激素作用，同時(shí)也是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，對心血管疾病表現(xiàn)出良好的積極作用[13]。本次研究結(jié)果中，盡管SIF組中的LDH活性和ET-1水平相比正常組明顯升高，但相比于模型組細(xì)胞，SIF可以顯著提高其存活率，并且增加了抗氧化酶SOD的活性以及抗氧化化酶HO-1的mRNA表達(dá)水平，氧化損傷指標(biāo)顯著降低。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIF降低氧化損傷的作用效果與雌二醇效果相當(dāng)。使用雌二醇干預(yù)氧化損傷引起的動(dòng)脈粥樣硬化在臨床應(yīng)用中已早有報(bào)道，但有報(bào)道稱，長期暴露于大劑量雌二醇中會引起惡性癌癥[14]發(fā)生。同時(shí)有研究[15]表明，染料木素可降低由雌二醇引起的內(nèi)皮損傷。SIF主要物質(zhì)為染料木素、大豆黃素等，因此，筆者認(rèn)為SIF在起到雌激素作用的同時(shí)，或許還可以降低雌激素過量引起的機(jī)體損傷。這為SIF在臨床中作為雌激素的替代品或作為應(yīng)用雌激素時(shí)的輔助品提供了可能。

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體GPR30在二十年前的人類乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，隨后在許多其他細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。有報(bào)道稱，GPR30無處不在，具有多種生物學(xué)作用，包括調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，免疫，神經(jīng)元和心血管功能[16]，以往的實(shí)驗(yàn)[17]發(fā)現(xiàn)，GPR30可以減少絕經(jīng)后的動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥的發(fā)生，揭示了GPR30的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能。有研究[18]表明，雌二醇可通過GPR30預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。因此，筆者推測具有類雌激素作用的SIF或許可以作用于心血管系統(tǒng)中的GPR30受體降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，并進(jìn)一步降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用GPR30受體特異性阻斷劑干預(yù)后，SIF降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用顯著降低，這也證實(shí)了筆者的推測。但有趣的是，在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，正常組細(xì)胞GPR30蛋白表達(dá)很低，但在ox-LDL引起氧化損傷后，GPR30表達(dá)顯著升高，或許二者之間存在著某種特殊關(guān)系，本次實(shí)驗(yàn)并未深入研究，這或?qū)⒊蔀榻酉聛淼年P(guān)注重點(diǎn)。但GPR30受體特異性阻斷后，與SIF組相比GPR30蛋白表達(dá)顯著降低，這至少證明了GPR30受體在SIF抗氧化損傷中起著重要作用。

綜上，筆者認(rèn)為SIF對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗氧化損傷的作用，并可能是通過調(diào)節(jié)GPR30受體完成。不足之處，在于本研究僅僅通過體外實(shí)驗(yàn)證明了GPR30拮抗在SIF降低氧化損傷的中作用，對其深層的作用機(jī)制未涉及，這將會是接下來的工作重點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-09-15 編輯：劉 斌）