鄧棋芳

廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科 518110

伴隨著妊娠期糖尿病(GDM)與妊娠預后關系研究的不斷深入，關于妊娠期糖尿病(GDM)的診斷標準逐漸降低，妊娠期糖尿病的發(fā)病率進一步提升[1-2]。妊娠期糖尿病孕婦的血糖如果不能得到控制不僅會對胎兒生長發(fā)育造成不良影響，而且也會對后期的成長造成很多長期影響，例如成年期2型糖尿病的發(fā)病率會明顯提升[3-4]。妊娠期糖尿病的發(fā)生與遺傳、生活方式等很多因素具有直接關系[5]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，不良的生活方式是造成妊娠期糖尿病發(fā)病率提升的關鍵因素，比如過多的妊娠期熱量攝入、較低的體力活動會引發(fā)妊娠期體重過多增加等[6-7]。孕婦營養(yǎng)過剩對血糖、胰島素水平以及合成不足等所致影響及機制暫未明了。因此有必要闡明胰島β細胞在妊娠并血糖升高時的功能及分子機制[8-9]。胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺的發(fā)育與配對盒因子6(Pax6) 的轉錄因子具有明顯的相關性。在鼠胰腺組織內(nèi)分泌細胞中可見Pax6的表達[10]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胰腺α細胞分泌胰高血糖素中，Pax6的表達具有重要作用[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞功能、胰島素生物合成均有Pax6的參與[12]。為了研究高脂飲食對妊娠大鼠胰島β細胞功能及Pax6信號通路表達的影響，通過給妊娠大鼠進行高脂高熱量飲食，從而建立了妊娠大鼠糖耐量及胰島素抵抗損傷模型。從而為妊娠期高脂肪飲食致孕婦高血糖，或 GDM的發(fā)病提供理論支持，予以報告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及其環(huán)境：8周齡雌性Wistar 未妊娠大鼠(健康清潔級)60只，體重：150～180g之間，20只雄性8周齡Wistar大鼠，體重：160～200g之間，購買于上海斯萊克有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫為(22.0±1.0)℃，濕度為40%～60%，飲水自由，晝夜交替12h。

1.1.2 分組和飼料：進行適應性喂養(yǎng)1周后根據(jù)雌雄3∶1的比例進行合籠，于第2天晨8時對各籠雌鼠予以棉簽涂取陰道栓，鏡下予以觀察，載玻片上出現(xiàn)3處不同視野精子記為陽性，并作為妊娠第1天(d1) 進行記錄，未檢測到3處不同視野精子的雌鼠繼續(xù)予以合籠飼養(yǎng)，2周后，仍未妊娠的大鼠則進行放棄。妊娠第1天對大鼠體重進行測量，隨機分組: 高脂肪飲食組和對照組，每組30只。兩組大鼠均進行自由進水。普通飼料量配比為脂肪12.8%，糖類61.5%，蛋白質25.7%；高脂飼料糖類及脂肪分別為 40%，蛋白質20%。在-20℃冰箱內(nèi)保存高脂飼料，普通飼料予以常溫環(huán)境保存。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)及稱重：飼養(yǎng)期間，每天均需對大鼠精神狀況、活動、毛色及飲水進食情況觀察。合籠期間必須每天清晨對托盤內(nèi)陰道栓情況觀察；每天記錄妊娠期間大鼠的食量，每隔2d記錄大鼠體重。

1.2.2 空腹血糖以及血清胰島素檢測：妊娠第2天(d2)及第20天(d20) ，大鼠的一般孕期為20～22d， 妊娠大鼠需要夜間禁食12h，第2天上午6—8點予以眼眶后靜脈叢取血1ml， 并對其空腹血糖(Fasting blood glucose concentration，F(xiàn)BG) 進行檢測(羅氏卓越型血糖儀及試紙)，取血靜置1h后低溫離心(4℃，5 000r/min，15min)，獲取上清。 將血清在-80℃的條件下冷藏，之后采用雙抗體夾心 ELISA 法對空腹胰島素水平(Fasting seruminsulin concentration，F(xiàn)INS)進行檢測。并對胰島素敏感指數(shù)(ISI)及HOMA模型的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR) 進行計算。ISI=1/(FBG×FINS);HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test，OGTT)和胰島素釋放試驗(Insulin release test，IRT):妊娠第20天取血進行 FGB、FINS的檢測后，根據(jù)2.0g/kg體重采用50%葡萄糖進行灌胃，在葡萄糖負荷后的0、15、30、60min，分別對大鼠尾靜脈取血約0.5ml并對血糖及血清胰島素水平測定。

1.2.4 標本取材:妊娠第20天取血后，頸椎脫臼處死后開腹獲取胰腺組織，試驗需在冰上進行，接觸組織的器械都需要進行無 RNA 酶處理，之后分別取3～5mm放到無 RNA 酶的 EP 管中，采用液氮速凍，保存在-80℃冰箱。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達:取液氮凍存好的胰腺組織，將其研磨成粉末，進行充分裂解30min后，在4℃的條件下進行12 000×g離心30min，提取上清。應用BCA蛋白活性測定將30μg蛋白進行10% SDS-PAGE，將電泳分離好的蛋白轉移到硝酸纖維素膜(PVDF)上，在室溫條件下在5%脫脂牛奶中進行反應1h，進行充分洗滌后分別添加一抗小鼠抗人胞Pax6單克隆抗體(1∶1 000)兔抗鼠Pdx1多克隆抗體(1∶1 000)以及兔抗人MafA單克隆抗體(1∶1 000)后，在4℃的條件下反應過夜，進行充分洗滌后添加二抗辣根過氧化物酶(HRP) 標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000) 或辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室溫條件下反應30min，進行充分洗滌后，采取ECL化學發(fā)光液反應1min，采用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行拍照觀察。

2 結果

2.1 高脂飲食對妊娠大鼠孕期體重影響 高脂飲食組大鼠孕期體重高于同期對照組大鼠，且高脂飲食組大鼠妊娠第13 天、19天體重均明顯高于同期對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重變化比較

2.2 高脂飲食對妊娠大鼠的 FBG、FINS的影響 大鼠妊娠第 20 天時， 高脂飲食組妊娠鼠的 FBG明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)，且產(chǎn)生高血糖癥狀；高脂飲食組妊娠鼠的FINS與對照組進行比較，無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 高脂飲食對妊娠大鼠的FBG、FINS的影響

2.3 高脂飲食對妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR水平的影響 對高脂飲食對妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR的影響的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠妊娠第20天時， 高脂飲食組妊娠大鼠的HOMA-IR明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。而高脂飲食組妊娠大鼠ISI與對照組進行比較，則不具有顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 高脂飲食對妊娠大鼠的 FBG、FINS的影響

2.4 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響妊娠 對高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響進行研究發(fā)現(xiàn)，大鼠妊娠第20天時，高脂飲食組妊娠大鼠OGTT各時間點的血糖值均明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響

2.5 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠IRT的影響 IRT的試驗結果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組妊娠大鼠0min、15min、30min、60min時間點胰島素釋放水平均低于對照組，15min、30min、60min時統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)。見表5。

表5 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠 IRT 的影響

2.6 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺Pax6蛋白及其相關蛋白表達的影響 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相關蛋白表達的影響研究表明，在妊娠晚期(d20)，高脂飲食組妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1、MafA的表達均明顯低于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表6及圖1～3。

圖1 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 Pax6表達水平

表6 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺 Pax6 及其靶基因表達的影響

3 討論

最近國內(nèi)外專家的研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠期糖尿病的發(fā)病中，飲食因素具有十分關鍵的作用[13-14]。很多研究人員從營養(yǎng)因素進行探索，希望可以發(fā)現(xiàn)預防妊娠期糖尿病發(fā)生、抑制妊娠期糖尿病發(fā)展并緩解妊娠期糖尿病結局的最好方法[15]。目前研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞功能損傷與GDM的發(fā)生具有直接關系，β 細胞的分化以及功能會受到很多轉錄因子調(diào)節(jié)，如Pax4、Pdx1、MafA、Pax6 等，目前這些轉錄因子之間存在的聯(lián)系已經(jīng)在動物實驗中得到證明[16-17]。Kanwar P等研究示：敲除 Pax6鼠胰腺內(nèi)分泌細胞的個數(shù)雖然沒有顯著改變，但鼠內(nèi)分泌功能會受到嚴重損傷[18]。對于維持胰島細胞功能，尤其是α和β細胞的分化，Pax6具有關鍵的意義。Pax6基因在小鼠胰腺發(fā)育的早期及成熟的內(nèi)分泌細胞中大量表達，研究表明對胰腺α細胞的分化，Pax6基因的表達十分關鍵[19]。并且最近的研究發(fā)現(xiàn)，Pax6 對β細胞關鍵基因編碼蛋白的轉錄可進行調(diào)控，從而影響胰島素生物合成及釋放。Pax6也能夠特異性的調(diào)控與胰島素基因轉錄的主要蛋白的表達[20]。胰十二指腸同源盒因子1(Pancreatic and duodenal homeobox factor-1，Pdx1) 能參與胰腺早期發(fā)育及成熟期β細胞分化。Pdx1在成熟的機體內(nèi)可以通過很多蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)β細胞功能，特別是對胰島素及胰島素相關基因進行調(diào)節(jié)[21]。在血糖調(diào)控胰島素蛋白表達的過程中，MafA具有重要作用，葡萄糖濃度能夠調(diào)控MafA的表達水平以及功能。MafA在糖尿病的狀態(tài)下，其表達量會出現(xiàn)減弱，從而對胰島素的合成和分泌造成影響。目前的研究發(fā)現(xiàn)，MafA基因缺陷小鼠的Pdx1和GLUT2的蛋白表達水平都出現(xiàn)降低，說明MafA是葡萄糖刺激下胰島素分泌的一種重要調(diào)控蛋白[22]。

圖2 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 Pdx1表達水平

圖3 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 MafA表達水平

實驗對妊娠期大鼠應用高脂肪飲食喂養(yǎng)，誘導產(chǎn)生糖耐量異常及胰島素抵抗，這種防范已經(jīng)廣泛應用于2型糖尿病動物實驗，并證明高脂飲食可誘發(fā)2型糖尿病。同時發(fā)現(xiàn)在妊娠晚期(d20)，高脂飲食組FBG、HOMA-IR明顯高于對照組，OGTT、IRT也有不同程度異常，Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1，MafA的表達均明顯下降。推測機體在高血脂以及高血糖的情況下，Pax6屬于基因轉錄調(diào)節(jié)的關鍵因子。

綜上所述，對妊娠期大鼠高脂及高熱卡飲食致其產(chǎn)生糖耐量異常以及胰島素抵抗，推測是由Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1、MafA表達變低所導致，從而在一定程度上揭示了孕婦孕期營養(yǎng)過剩容易發(fā)生妊娠期糖尿病的機制。本研究可為妊娠期孕婦營養(yǎng)膳食提供理論依據(jù)，為妊娠期糖尿病以及具有高危風險的孕婦提供合理膳食指導，因國內(nèi)外對此研究較少，其機制和后續(xù)信號通路還需要進行下一步的研究驗證。