朱艷平，劉 佳,2，何 勇，岳 鋒，李文明,2，郭東光，孟廣超，王選年,2

（1.新鄉(xiāng)學院 生命科學與基礎(chǔ)醫(yī)學學院 動物疫病分子診斷河南省工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.鄭州大學 生命科學技術(shù)學院，河南 鄭州 450000）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒之一，其致病力與毒株類型直接相關(guān)。PCV2分型的依據(jù)是ORF2的序列差異。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e 5個亞型，其中PCV2b是當前主要流行的基因型[1-2]。當前國內(nèi)呈現(xiàn)不同基因亞型同時流行的新形勢[1,3-4]，PCV2a和PCV2b混合感染增多，PCV2d感染也出現(xiàn)增加趨勢，并且呈現(xiàn)出成為感染主要亞型的趨勢[5]。為控制PCV2引起的相關(guān)疾病，減輕養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟損失，世界各地都廣泛接種PCV2疫苗。因此，有必要研究新的疫苗或疫苗佐劑，用于PCV2的預防。

PCV2基因組包含11個重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中ORF1和ORF2是PCV2復制和發(fā)病所需的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白[6]。ORF1編碼病毒DNA環(huán)狀復制所必需的Rep和Rep’蛋白。PCV2的ORF2編碼的Cap蛋白是PCV2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要免疫原性蛋白，包含若干個主要保護性抗原的線性B細胞表位及中和性抗原表位，常被研制成PCV2亞單位疫苗應用于生產(chǎn)[7]。各公司疫苗的免疫效果各不相同，其中，疫苗抗原和佐劑發(fā)揮了重要作用。目前，PCV2疫苗佐劑的研究主要集中在脂質(zhì)體和細胞因子等方面[8-9]，其中，細胞因子佐劑是重點研究對象，包括白細胞介素2（Interleukin-2，IL-2）、IL-18、干擾素γ（Interferon γ，IFN-γ）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等。目前，IL-21作為疫苗佐劑的研究較少，但其具有正向調(diào)節(jié)機體免疫應答的功能，可用于疫苗佐劑的開發(fā)。

PCV2感染時，IL-17表達水平上升[6]，這是IL-6與其受體結(jié)合活化輔助性T細胞17（Th17細胞）的結(jié)果。Th17細胞主要分泌IL-17和IL-21，而IL-21能夠增強B細胞分泌抗體的能力，還能促進Th17細胞分化，分泌IL-17和IL-21[10]。目前，PCV2 Cap蛋白刺激細胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化的研究，主要包括IL-2、IFN-γ、IL-10等[6,11-12]，還未見關(guān)于IL-21和IL-17A的報道。因此，以豬IL-17A和IL-21基因為研究對象，檢測PCV2 Cap蛋白刺激的PBMCs中IL-17A和IL-21的轉(zhuǎn)錄水平，并初步研究調(diào)節(jié)IL-17A和IL-21的機制，為后期開發(fā)疫苗增強劑以及研究PCV2 Cap蛋白刺激過程中IL-21與其他細胞因子的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 3月齡健康的PCV2抗體陰性的長白仔豬2頭，體重為15 kg，購自新鄉(xiāng)某豬場。

1.1.2 PCV2 以及PCV2 Cap蛋白 PCV2由新鄉(xiāng)學院生命科學與基礎(chǔ)醫(yī)學學院和生物技術(shù)研究中心從臨床分離、保存；PCV2 Cap蛋白由新鄉(xiāng)學院生命科學與基礎(chǔ)醫(yī)學學院和生物技術(shù)研究中心制備、保存。

1.1.3 主要試劑 RNA抽提試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs和TB Green Premix Ex Ⅱ（寶生物工程（大連）有限公司），Trizol（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器 倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）、熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司）、超純水儀（美國MILLIPORE公司）、全自動制冰機（日本Panasonic公司）、大容量水平離心機（美國Thermo Fisher公司）、微型離心機（北京昊諾斯生物有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1IL-21和IL-17A實時熒光定量PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank中β-actin、IL-17A、IL-21和PD-L1的基因序列，使用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計熒光定量PCR特異性引物，用于擴增目的片段，引物設(shè)計后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 IL-21、IL-17A和 β-actin的實時熒光定量PCR引物序列

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測PCV2感染豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化 通過前腔靜脈采集健康豬抗凝血，按照何勇等[13]的方法分離PBMCs。將獲得的PBMCs在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用PCV2體外感染PBMCs后，分別在感染后12、24、36、48、60、72 h收取細胞，采用RNA提取試劑盒提取PCV2感染后PBMCs的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟如下：37℃孵育15 min，85℃水浴5 s，4℃冷卻，即為cDNA。利用設(shè)計的實時熒光定量PCR引物，進行β-actin、豬IL-17A和IL-21的實時熒光定量PCR，檢測IL-17A和IL-21的表達水平。實時熒光定量PCR擴增體系（總體積20 μL）：TB Green Premix Ex Ⅱ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，DNA 2 μL，無菌水6 μL。實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃反應34 s，共40個循環(huán)。每次循環(huán)結(jié)束進行熒光信號的檢測，每個樣品3個重復。以β-actin作為內(nèi)源性對照，采用2-ΔΔCt分析方法計算IL-21和IL-17A的相對表達值，并將正常對照組時mRNA含量定義為1倍，可得出不同時間點IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測PCV2 Cap蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化 將PCV2 Cap蛋白按0.2 μg/mL刺激分離的PBMCs，同時設(shè)置細胞對照，每個樣品3個重復，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中吸附培養(yǎng)60 min；用PBS洗去未吸附的蛋白，將處理后的PBMCs加入RPMI1640培 養(yǎng) 基（包 含 有6 μg/mL的ConA、2%的 胎牛血清、無菌PCV2抗體陰性豬血清）進行培養(yǎng)；分別在12、24、36、48、60、72 h收取細胞，按照1.2.2建立的方法檢測PCV2 Cap蛋白刺激的豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平，分析其轉(zhuǎn)錄水平變化情況。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化 為研究IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化的機制，根據(jù)Yue等[14]建立的實時熒光定量PCR方法，檢測PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激的豬PBMCs中PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化情況，初步分析IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化的調(diào)節(jié)機制。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 26軟件進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，并用獨立樣本t檢驗分析結(jié)果進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光定量PCR檢測PCV2刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化水平

如圖1所示，IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，并且在60～72 h上調(diào)最明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，48 h轉(zhuǎn)錄水平達到最低值。IL-21mRNA在12～24 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，如圖1A所示。IL-17A mRNA在12～36 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，48 h達到最低值，如圖1B所示。因此，由圖1可知，PCV2刺激PBMCs后IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，并且在12～24 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），60 h達到峰值，其中48 h降低至最低。以上結(jié)果說明PCV2在體外能夠提高細胞因子IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖1 PCV2刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄變化

2.2 實時熒光定量PCR檢測PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化水平

如圖2所示，IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，并且在60～72 h上調(diào)最明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，48 h轉(zhuǎn)錄水平達到最低值。IL-21mRNA在12～24 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，48 h達到最低值，甚至低于正常細胞的轉(zhuǎn)錄水平，如圖2A所示。IL-17A mRNA在12～36 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，48 h達到最低，如圖2B所示。因此，由圖2可知，PCV2 Cap蛋白刺激后IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，并且在12～24 h、60～72 h上調(diào)明顯（P＜0.01），60 h達到峰值，其中48 h降低至最低。以上結(jié)果說明PCV2 Cap蛋白在體外能夠模擬PCV2提高細胞因子IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平，并且對IL-21轉(zhuǎn)錄水平提高更明顯，幾乎是PCV2刺激后轉(zhuǎn)錄水平的2倍。

圖2 PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄變化

2.3 實時熒光定量PCR檢測PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1基因轉(zhuǎn)錄變化水平

按照Yue等[14]的檢測方法和計算方法檢測PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs后PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖3所示。PCV2刺激PBMCs后PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，并且在48～72 h上調(diào)最明顯（P＜0.01），48 h達到峰值（圖3A）；PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs后PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在12 h和60 h明顯上調(diào)（P＜0.01），12 h達到峰值（圖3B）。但是，比較PCV2和PCV2 Cap蛋白對PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)PCV2顯著提高PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.01），幾乎是PCV2 Cap 蛋白刺激時的2倍，這與前期關(guān)于PCV2自然感染豬時PD-L1的研究結(jié)果相一致[14]。以上結(jié)果說明PCV2 Cap 蛋白能夠模擬PCV2提高PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平，但是轉(zhuǎn)錄水平低于PCV2刺激時的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3 PCV2 和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平的變化

3 討 論

IL-21與其他的細胞因子如IL-2、IL-4、IL-15等的空間結(jié)構(gòu)一致，其受體為IL-21R（interleukin-21 receptor），與IL-2家族具有相同的結(jié)構(gòu)特征，歸類于IL-2家族。在正常細胞中IL-21不表達，當細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)時IL-21才表達。鏈霉菌屬的抗生素或其他類似抗體等，都可以誘導IL-21的表達。IL-21主要是由活化的 CD4+T（主要是Th2）細胞、NKT細胞及樹突狀細胞分泌[15]，Th17細胞也分泌表達[16]。IL-21發(fā)揮其各種功能時，需要與他的受體IL-21R結(jié)合。IL-21對所有的淋巴細胞都有調(diào)節(jié)效應，主要是影響 CD4+ T細胞的發(fā)育、促進B細胞的增殖分化、調(diào)節(jié)B細胞的類型轉(zhuǎn)換和抗體分泌，還可促進CTL細胞數(shù)量的增加，誘導CD8+T 和NK細胞的細胞毒性效應和功能，強化細胞毒活性等，使其在感染性疾病中發(fā)揮重要作用。豬IL-21基因是在豬第8號染色體上，其cDNA全長共456 bp[17]。豬IL-21基因在同源性上與人和某些動物的氨基酸序列具有相似性，其中，與牛同源性最高，其次是人，最低的是鼠。

目前PCV2疫苗研究主要集中在疫苗抗原的研究，如通過各種表達系統(tǒng)，獲得PCV2 Cap 的重組蛋白，用于疫苗抗原的制備。武樂祎等[18]通過CHO-K1系統(tǒng)制備了PCV2 Cap蛋白，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體。通過分析比較，發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap 蛋白能夠和PCV2一樣刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化，說明PCV2 Cap蛋白具有PCV2抗原的特性。同時還發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，是PCV2刺激后轉(zhuǎn)錄水平的近2倍。而IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平和PCV2刺激后的轉(zhuǎn)錄水平基本保持一致。以上研究進一步表明，前期制備的PCV2 Cap蛋白能夠模擬PCV2的病毒粒子，刺激IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平的上升。又由于IL-21發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)的作用，因此，可以將Cap作為PCV2疫苗抗原的候選抗原，用于PCV2疫苗的研究。

利用豬IL-21和IL-17A基因的實時熒光定量PCR檢測方法，檢測PCV2和PCV2 Cap蛋白體外刺激后PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，PCV2 Cap蛋白和PCV2刺激后，豬IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，在第60 h達到峰值；IL-21的轉(zhuǎn)錄水平在48 h降至最低，甚至低于正常水平，這可能是由于IL-21的表達水平受PD-1∶PD-Ls通路的調(diào)節(jié)，IL-17A的表達水平又受IL-21的調(diào)節(jié)。PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在48 h達到峰值，導致IL-21的轉(zhuǎn)錄水平最低值。這個研究結(jié)果與Zhang等[19]研究流感病毒H9N2病毒粒子感染的結(jié)果一致，當感染流感病毒H9N2的病毒粒子后，PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在24 h達到峰值，但轉(zhuǎn)錄水平遠低于流感病毒H9N2感染時的轉(zhuǎn)錄水平。又有研究證明，IL-21和IL-17A的表達受PD-1∶PD-L1通路的調(diào)節(jié)[17]。PCV2自然感染過程中，PD-L1的表達水平升高更明顯，發(fā)揮主要作用[14]，導致機體的免疫抑制。因此，將PD-L1作為檢測對象，研究PD-L1與IL-21、IL-17A的關(guān)系。通過檢測PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白能模擬PCV2刺激PD-L1轉(zhuǎn)錄水平變化，但是與PCV2感染時轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢并不完全一致，并且PCV2刺激時PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平更高；PCV2 Cap蛋白與PCV2刺激PBMCs時，PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平變化調(diào)節(jié)IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平。因此，PD-L1轉(zhuǎn)錄水平的升高，刺激IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，當升高到一定水平時則發(fā)揮抑制作用。但是，目前PCV2 Cap蛋白刺激時PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平變化與IL-17A和IL-21基因轉(zhuǎn)綠的調(diào)節(jié)機制還不清楚，這需要后期進一步研究證實，這也是目前課題重點研究的內(nèi)容。

綜上所述，PCV2和PCV2 Cap蛋白在體外能夠刺激PBMCs，導致PD-L1、IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，其中PCV2 Cap蛋白導致IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高更多，幾乎是PCV2 刺激時的2倍；IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平基本和PCV2刺激保持一致，PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有PCV2刺激時的轉(zhuǎn)錄水平高。以上研究為后續(xù)研究PCV2 Cap蛋白刺激的IL-21與IL-17A和其他細胞因子的關(guān)系以及對機體免疫功能的影響奠定了理論基礎(chǔ)。