陳秀娟，李科志，唐艷萍，涂 鑫，駱成飄，歐 超，曹 驥，楊 春△

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.實驗研究部；2.病理科；3.檢驗科,南寧 530021）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是威脅人類健康的全球性問題，若不及時、規(guī)范治療，可能會產(chǎn)生乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等并發(fā)癥，嚴重時危及生命。隱匿性HBV 感染（OBI）是指血清乙肝表面抗原陰性、肝組織存在具有復(fù)制能力的HBV DNA，伴或不伴有血清HBV DNA陽性[1]。根據(jù)HBV血清學(xué)標志物特點，OBI 可分為血清抗體陽性型（HBcAb陽性伴或不伴HBsAb 陽性）和血清抗體陰性型（HBcAb、HBsAb 均陰性）。自1978 年Hoofnagle等[2]首次報道了輸注HBsAg（-）/抗-HBc（+）血液引起受血者HBV持續(xù)感染，OBI越來越受到人們的關(guān)注。

樹鼩（tree shrew）是一種小型實驗動物，已廣泛應(yīng)用于多種病毒感染性疾病研究，如HBV、流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、腸道病毒71 型、輪狀病毒等[3]。本課題組前期建立了實驗室人工繁育樹鼩的基本方法，用培育的樹鼩幼崽接種HBV，逐步證實HBV 能在樹鼩體內(nèi)復(fù)制，建立一過性感染、急性感染、隱匿性感染、慢性感染等不同HBV 感染狀態(tài)模型[4-5]。腸道菌群是指在腸道定居并生長的微生物群落，其在維持宿主的新陳代謝、免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。有研究表明，腸道菌群失調(diào)與宿主多種疾病有關(guān)，如2 型糖尿病[6]、潰瘍性結(jié)腸炎[7]、克羅恩病[8]、鼻咽癌[9]、高血壓[10]、慢性腎臟病[11]、哮喘[12]等。腸道菌群可以影響HBV 感染狀態(tài)。Chou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，運用抗生素清潔腸道可以顯著延長小鼠HBsAg 清除時間、降低HBV DNA 清除率，從而使HBV 轉(zhuǎn)為持續(xù)感染狀態(tài)。Zhu 等[14]亦發(fā)現(xiàn)，一過性和急性HBV感染小鼠腸道菌群隨HBV感染狀態(tài)變化而改變，這可能與腸道菌群參與宿主介導(dǎo)HBV 特異性免疫應(yīng)答有關(guān)。關(guān)于腸道菌群對持續(xù)OBI的影響報道尚不多見。本研究基于課題組前期建立的樹鼩持續(xù)OBI動物模型，通過比較樹鼩腸道菌群改變，擬從腸道菌群角度探討OBI機制。

1 材料與方法

1.1 持續(xù)OBI 樹鼩模型的建立 經(jīng)患者知情同意和醫(yī)學(xué)倫理委員會批準后，采慢性乙型肝炎患者血清作為感染源，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。此感染源HBV血清學(xué)標志物HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+），HBV-DNA為7.53×108IU/mL，HBV為C基因型。

新生樹鼩分別于出生的第1、第3天經(jīng)雙股內(nèi)側(cè)皮下接種300 μL HBV 病毒液，對照組不作任何處理。分別于樹鼩出生后第8、第10、第12、第16、第20、第24、第48、第72 周，經(jīng)股靜脈采血1.5 mL，常規(guī)分離后保存于-80 ℃冰箱中。所有動物均飼養(yǎng)于（20±2）℃、濕度40%～60%清潔環(huán)境。所有操作均符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會標準，動物使用許可證號：SYXK-桂2020-0004。

1.2 樹鼩血清HBV標志物、HBV DNA拷貝數(shù)動態(tài)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測樹鼩血清HBsAg、HBsAb、HBcAb，實時熒光定量PCR（qPCR）TaqMan 探針法檢測樹鼩血清HBV DNA。HBsAg、HBsAb、HBcAb 檢測試劑盒均購自上?？迫A生物工程股份有限公司，HBV DNA 檢測試劑盒購自中山達安生物技術(shù)有限公司。PCR 儀（Light-Cycler480 型Ⅱ）購自瑞士Roche公司。

1.3 樹鼩糞便收集和16S rDNA V3+V4區(qū)高通量測序 所有樹鼩一般狀態(tài)良好，排除稀便、黑便、尿液或毛發(fā)污染等不合格糞便樣本，收集合格標本，取少許常溫保存行大便潛血實驗進一步質(zhì)控，剩余部分液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。采用膠體金法對18例糞便行大便潛血實驗，結(jié)果均為陰性，無消化系統(tǒng)疾病，標本合格，可用于后續(xù)實驗。提取糞便總DNA，采用帶Barcode 接頭特異性引物對16S rDNA V3+V4區(qū)進行PCR擴增，產(chǎn)物純化、擴增子接頭、構(gòu)建DNA文庫，Illumina平臺PE250上機雙端測序。腸道菌群特異性引物序列：341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’。

1.4 數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析 采用FASTP（版本0.18.0）軟件過濾Illumina 低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，F(xiàn)LASH（版本1.2.11)軟件讀取、拼接原始數(shù)據(jù)，USEARCH（版本7.1）軟件UCHIME 算法去除嵌合體、UPARSE 算法以O(shè)TU 相似性＞97%進行聚類（operational taxonomic units,OTU）。OTU 注釋在SILVA SSU rRNA 數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)中進行。通過QIIME（版本v.1.30.1)軟件中Mothur 算法計算基于OTUs水平α多樣性、β多樣性等相關(guān)指標。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 對于腸道菌群分析，采用主坐標分析（PCoA）、非度量多維標度分析（MNDS)計算樣本間距離，使用非參數(shù)Wilcoxon 秩和檢驗分析α 多樣性、β 多樣性，Anosim 檢驗比較分組信息。同時，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗、Wilcoxon秩和檢驗、線性判別分析（LDA＞2）標準進行LEfSe在線分析（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩血清HBsAg、HBsAb、HBcAb 和HBV DNA載量檢測結(jié)果 在8～72周的觀察期內(nèi)，根據(jù)血清HBsAg、HBsAb、HBcAb 和HBV DNA 動態(tài)結(jié)果共有21 只樹鼩符合持續(xù)性O(shè)BI 標準[1]?？紤]年齡、性別因素，篩選10 只樹鼩作為OBI 組（n=10），8只未經(jīng)干預(yù)樹鼩作為正常對照（NC組，n=8）。兩組樹鼩雌雄各半、年齡相近。

OBI組樹鼩血清HBsAg均為陰性，HBcAb多呈陽性（9/10），呈血清抗體陽性型；HBsAb（-）伴HBcAb（-）僅1 只，呈血清抗體陰性型。OBI 組樹鼩HBV DNA 載量呈間歇性低水平波動狀態(tài)，大多低于200 IU/mL，少數(shù)HBV DNA＞200 IU/mL。在觀察期內(nèi)，有4 只樹鼩（分別為y59-4、271-1、y61-1 和y61-3 號樹鼩）血清HBV DNA 自發(fā)升高10 倍以上，伴HBsAg（-）/HBsAg（+）血清學(xué)轉(zhuǎn)換，其中y59-4 號樹鼩血清HBV DNA 較長時間保持在相對高水平（與基線水平相比，14～24 周），另外3 只樹鼩隨血清HBsAb 出現(xiàn)，HBsAg 很快恢復(fù)陰性，血清HBV DNA 也降至基線水平，見圖1。觀察期內(nèi)，NC 組樹鼩血清均未檢測出HBsAg、HBsAb、HBcAb和HBVDNA。

圖1 持續(xù)OBI樹鼩血清HBV DNA拷貝數(shù)動態(tài)變化

2.2 持續(xù)OBI對樹鼩腸道菌群OTUs影響 雙端測序后OBI 組共得到1 073 881 對原始序列，NC 組共得到871 666 對原始序列，經(jīng)質(zhì)量控制后，OBI 組和NC 組分別得到789 098、622 737 對有效測序序列，有效率為73.48%和71.44%。將有效序列進行OTU聚類，OBI 組和NC 組平均每個樣本分別得到1 320和1 299 OTU，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；贠TU的生物多樣性稀釋曲線顯示可檢出的OUT數(shù)隨測序深度增加已達平臺期，表明此次測序深度足以覆蓋大多數(shù)物種。相對豐度曲線表明，OBI 組物種豐富度高于NC 組，OBI 組樣本間物種均勻度優(yōu)于NC組，見圖2。

圖2 持續(xù)OBI對樹鼩腸道菌群OTUs影響

2.3 持續(xù)OBI 對樹鼩腸道菌群α 多樣性影響 采用Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Sobs 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、PD 指數(shù)等指標反映腸道菌群α 多樣性。兩組樹鼩腸道菌群Chao1指數(shù)、Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在系統(tǒng)進化角度，兩組樹鼩腸道菌群PD 指數(shù)比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明持續(xù)OBI對樹鼩腸道菌群α多樣性無顯著影響。

2.4 持續(xù)OBI 對樹鼩腸道菌群β 多樣性影響 采用PCoA、MNDS 等方法來分析不同樣本組內(nèi)和組間的菌群差異，探討持續(xù)OBI 對樹鼩腸道菌群β 多樣性影響。PCoA結(jié)果顯示，PCo1和PCo2兩種主坐標貢獻率分別為11.73%、10.54%，OBI組和NC組樹鼩糞便菌群在進化距離上區(qū)分明顯（圖3A）；NMDS結(jié)果顯示stress 值為0.085，表明模型相似性高(圖3B)。在OUT 水平，分別采用Wilcoxon 檢驗和Anosim檢驗計算OBI組和NC組樹鼩腸道內(nèi)菌群在組內(nèi)和組間進化距離，分析組間距離與組內(nèi)距離差異性。結(jié)果顯示，OBI 組和NC 組樹鼩腸道菌群組內(nèi)距離無明顯差異（P＞0.05），組間距離差異明顯（P＜0.01），表明OBI 組和NC 組樹鼩腸道菌群的組間差異大于組內(nèi)差異，持續(xù)OBI可以降低樹鼩腸道菌群β多樣性，見圖3C、圖3D。

圖3 持續(xù)OBI對樹鼩腸道菌群β多樣性影響

2.5 持續(xù)OBI 對樹鼩腸道糞便樣本物種組成差異性影響 為了進一步探討持續(xù)OBI 對樹鼩腸道菌群物種組成的影響，本研究從門、綱、目、屬等分類學(xué)水平分別對樹鼩腸道內(nèi)前10 優(yōu)勢物種進行差異性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在門水平，樹鼩腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、Epsilonbacteraeota、藍藻門（Cyanobacteria）等組成，其相對豐度在OBI組和NC組樹鼩腸道菌群占比分別為99.72%、99.84%。其中，OBI 組樹鼩腸道內(nèi)厚壁菌門的相對豐度（%）顯著高于NC組（P＜0.05），擬桿菌門在OBI 組和NC 組相對豐度（%）無顯著差異（P＞0.05）。與NC 組相比，OBI 組樹鼩厚壁菌門/擬桿菌門比值（F/B）無明顯差異(P＞0.05）。在綱水平，持續(xù)OBI主要影響樹鼩腸道梭狀芽孢桿菌（Clostridia），其在OBI 組樹鼩腸道相對豐度顯著高于NC 組（P＜0.01）；在目水平，持續(xù)OBI 主要影響樹鼩腸道梭狀芽孢桿菌（Clostridiales），OBI 組樹鼩腸道梭狀芽孢桿菌目相對豐度顯著高于NC組（P＜0.01）；在屬水平，OBI組樹鼩腸道大腸埃希―志賀菌（Escherichia-Shigella）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）均顯著低于NC 組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同分類學(xué)水平樹鼩腸道內(nèi)前10優(yōu)勢物種組成差異性分析

2.6 LEfSe法分析持續(xù)OBI對樹鼩腸道菌群影響 OBI 組和NC 組差異性菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門組成。OBI組樹鼩腸道厚壁菌門主要包括梭菌綱（Clostridia，LDA=3.75，P=0.001）、梭菌目（Clostridiales，LDA=3.72，P=0.0059）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae，LDA=3.42，P=0.016）、毛螺菌屬（Lachnoclostridium，LDA=2.74，P=0.0076）；NC組則主要由氣球菌科（Aerococcaceae，LDA=2.47，P=0.033）、氣球菌屬（Aerococcus，LDA=2.86，P=0.0019）、氣球菌種（Aerococcus_urinaeequi，LDA=2.25，P=0.015）、Lactobacillus_ruminis（LDA=3.01，P=0.0032）組成。在擬桿菌門方面，OBI 組樹鼩腸道菌群主要包括脆弱擬桿菌（Bacteroides_fragilis，LDA=3.07，P=0.037）、普氏菌屬7（Prevotella_7，LDA=3.27，P=0.00042）、Muribaculaceae（LDA=2.58，P=0.041）；NC 組樹鼩腸道則由Myroides（LDA=2.82，P=0.00058）、Myroides_odoratimimus（LDA=3.02，P=0.00035）、Bacteroides_coprophilus_DSM_18228_JCM_13818（LDA=3.37，P=0.016）等組成。在變形菌門方面，OBI組樹鼩腸道菌群主要由Succinivibrionaceae（LDA=2.42,P=0.034）、Snodgrassella（LDA=2.13，P=0.024）、Snodgrassella_alvi（LDA=2.13,P=0.024）、克雷伯菌屬（Klebsiella，LDA=3.00，P=0.033）組成；NC 組樹鼩腸道菌群則由Vibrionales（LDA=2.50，P=0.0049）、Vibrionaceae（LDA=2.50,P=0.0050）、Moraxellaceae（LDA=2.59，P=0.0077）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，LDA=2.51,P=0.012）、大腸埃希―志賀菌屬（Escherichia-Shigella，LDA=4.21，P=0.021）組成，見圖5。這些差異菌群均可能成為持續(xù)OBI潛在的生物標志物。

圖5 樹鼩腸道內(nèi)前50種主要物種LEfSE分析

3 討論

OBI由于其特殊性，感染者不易被發(fā)現(xiàn)，多進展為肝硬化、肝癌等終末期。目前普遍認為，OBI是隱源性肝癌的主要病因，整體臨床預(yù)后比HBV/HCV相關(guān)性肝癌更差[15]。在慢性丙型肝炎、酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝病等疾病中，OBI是其獨立危險因素，可以顯著增加肝癌的發(fā)病率[16-17]。OBI還與肝移植、輸血安全、血液透析等密切相關(guān)[16]。Candotti等[18]追蹤了3 例血清HBsAg 陰性、HBV＜20 IU/mL多次獻血OBI感染者，在31位受血者中，9位受血者確診感染HBV，這嚴重影響輸血安全。因此，探討OBI機制，清除HBV DNA顯得尤為重要。

本研究中，通過給新生樹鼩皮下注射106～107IU/mL HBV DNA 病毒液，使樹鼩血清HBsAg（-）/HBV DNA（+），成功構(gòu)建了樹鼩持續(xù)OBI 動物模型。在持續(xù)OBI樹鼩中，HBV血清標志物的表達模式呈多樣性，以HBcAb(+)最為多見；血清HBV DNA 呈間歇性低水平波動狀態(tài)，大多低于200 IU/mL，這與樊璐[19]、周怡等[20]、Wu 等[21]等報道結(jié)果一致，符合OBI 的表現(xiàn)形式。此外，在OBI 樹鼩中，乙肝表面標志物表達形式和血清HBV DNA水平并非一成不變。在OBI 組樹鼩中，有4 只（分別為y59-4號、271-1 號、y61-1 號和y61-3 號）樹鼩血清HBV DNA 自發(fā)性升高10 倍以上，伴HBsAg（-）/HBsAg（+）血清學(xué)轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為HBV再激活，這為臨床OBI患者敲響警鐘，尤其是即將或正在接受免疫抑制治療患者[22]。值得注意的是，即使特異性HBV 表面標志物均未檢出，但血清仍可持續(xù)檢出低滴度HBV DNA（277-4 號樹鼩），這為減少HBV 感染漏診、傳播和預(yù)防OBI再激活等提出了新的挑戰(zhàn)。

由于肝臟70%血液是由門靜脈供應(yīng)，腸源性毒素、腸道菌群移位、微生物代謝產(chǎn)物等會不斷進入肝臟，進而調(diào)節(jié)肝臟特異性免疫應(yīng)答，影響HBV 感染狀態(tài)，HBV感染亦可影響腸道微生物群落的多樣性和組成。Zhu等[14]觀察5～7周齡一過性HBV感染和持續(xù)HBV 感染小鼠腸道菌群動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)HBV感染可以延緩小鼠腸道菌群發(fā)育，影響其多樣性。Yun等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在HBsAg陽性的HBV攜帶者中，ALT 升高的患者腸道菌群多樣性顯著低于ALT正常的攜帶者，表明腸道菌群多樣性可能與肝功能損害程度有關(guān)。本研究中，持續(xù)OBI可以顯著降低樹鼩腸道菌群β 多樣性，這可能是由于樹鼩出生即接種HBV 致使腸道內(nèi)某些細菌無法生長和定植，這還需要進一步研究。厚壁菌門大多為革蘭氏陽性菌，可以吸收、消耗大量能量，其被認為與肥胖、脂代謝、胰島素抵抗有關(guān)[24-25]。本研究中，OBI組樹鼩腸道內(nèi)厚壁菌門相對豐度顯著高于NC組（P＜0.05)，表明HBV介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答需要增加能量消耗，腸道菌群可能通過增加能量消耗促進HBV特異性免疫應(yīng)答[26]。梭狀芽孢桿菌（Clostridia）是胃腸道中最常見的革蘭陽性菌之一。Atarashi 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌能促進小鼠表達TGF-β、IL-10，抑 制TNF-α、IL-17 表達，從而促 進CD4+、FOXP3+Treg 細胞增殖和分化，促進Treg 細胞的歸巢，其機制可能與梭狀芽胞桿菌XIVa、IV、XVIII 決定簇和產(chǎn)生丁酸鹽、異丁酸鹽等短鏈脂肪酸有關(guān)。短鏈脂肪酸（SCFAs）在維持健康方面具有多種功能，如增強上皮屏障功能，降低炎癥水平，促進外周血Treg細胞的生成等[28]。丁酸鹽是短鏈脂肪酸的一種，是腸道黏膜細胞的主要能量來源，可以激活抗炎因子TGF-β、IL-10，抑制組蛋白脫乙?；傅幕钚裕抡{(diào)NF-κβ 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[29]，在本研究中，持續(xù)OBI 樹鼩腸道中產(chǎn)生丁酸鹽的梭狀芽胞桿菌（Clostridia）相對豐度顯著高于NC 組，表明其可能通過上述途徑參與HBV介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，膽汁酸是微生物的重要調(diào)節(jié)因子，膽汁酸的異常會導(dǎo)致微生態(tài)失調(diào)。在本研究中，OBI 組樹鼩腸道內(nèi)產(chǎn)生次級膽汁酸的梭狀芽孢桿菌（Clostridiales）顯著高于NC 組（P＜0.05)，表明持續(xù)OBI 可以通過改變腸道菌群組成影響膽汁酸的代謝。

本研究基于前期實驗室成功構(gòu)建的樹鼩持續(xù)OBI 動物模型，比較了持續(xù)OBI 樹鼩和正常樹鼩腸道內(nèi)微生物差異，這為進一步研究OBI潛在的免疫學(xué)機制、減少HBV傳播、預(yù)防HBV再激活等提供了新思路。