陳巧玲，白亦光

（川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院四川省南充市中心醫(yī)院 1.腫瘤科：2.骨科，南充 637000）

結(jié)腸癌是40～50 歲年齡組常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)生于結(jié)腸部位，占胃腸道腫瘤的第3位[1]。結(jié)腸癌是與遺傳因素和飲食習(xí)慣密切相關(guān)的疾病，嚴(yán)重影響國(guó)民的生命健康。目前結(jié)腸癌的發(fā)病率仍在逐年升高，由于其早期發(fā)現(xiàn)率低，晚期死亡率高，患者預(yù)后較差[2]。對(duì)于結(jié)腸惡性腫瘤治療方式仍然是以化療和手術(shù)為主[3]。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種抗代謝類嘧啶類似物，是臨床常用的腫瘤化療藥物[4]。但由于個(gè)體差異或腫瘤細(xì)胞易耐藥等原因，有些患者的治療效果并沒有達(dá)到理想的狀態(tài)[5]。因此，需要不斷嘗試更好的治療策略來治療結(jié)腸癌。色素上皮衍生因子（PEDF）是一種屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的內(nèi)源性糖蛋白，具有很強(qiáng)的神經(jīng)分化活性。近年來發(fā)現(xiàn)，PEDF 具有抑制新生血管生成和抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種功能[6]。因此，補(bǔ)充PEDF 蛋白和（或）增強(qiáng)內(nèi)源性PEDF表達(dá)可能是治療癌癥的一種新的治療策略。本研究旨在觀察PEDF 聯(lián)合5-FU在體外共同干預(yù)CT26細(xì)胞株以及在體內(nèi)治療結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型的效果，為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)，中國(guó)）。RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液（Sigma）；胎牛血清（FBS）和胰酶（Thermo 公司，美國(guó)）；5-FU（江蘇豪森醫(yī)藥公司，中國(guó)）；Transwell 小室（直徑為6.5 mm，孔徑為8 μm；Corning 公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)）；原位凋亡檢測(cè)（TUNEL）試劑盒（Promega 公司，美國(guó)）；重組小鼠PEDF 蛋白（Abcam 公司，英國(guó)）。低溫離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國(guó)）；熒光倒置顯微鏡（Olympas公司，日本）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 分離CT26 細(xì)胞株至T75 培養(yǎng)瓶，添加含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 雌性小鼠24 只購(gòu)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4～6周齡，體重18～20 g，無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)在溫度22～25 ℃，濕度55%的SPF 動(dòng)物房中。將小鼠飼養(yǎng)在獨(dú)立通氣籠（IVC 籠）中，12 h/12 h明暗交替，動(dòng)物自由攝食、飲水。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集CT26細(xì)胞接種于6孔板中，添加細(xì)胞5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)至融合度90%，使用移液槍頭在6孔板細(xì)胞上劃痕，PBS液清洗2 次，將細(xì)胞分為對(duì)照組、5-FU 組和PEDF+5-FU 組。分別加入1 mL PBS、1 mL（5 μg）5-FU、0.5 mL（50 μg）PEDF+0.5 mL（2.5 μg）5-FU，每組各加入原培育基1 mL，每組均設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。分別0 h、24 h顯微鏡下觀察并照相，測(cè)量記錄劃痕間距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值記錄。

1.5 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell 小室置于24孔板上，分為3組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。收集無(wú)血清饑餓12 h 的CT26 細(xì)胞，在每組上室均加入無(wú)血清細(xì)胞懸液2×105/100 μL。各組上室中分別加入100 μL PBS、100 μL（5 μg）5-FU、50 μL（50 μg）PEDF+50 μL（2.5 μg）5-FU，下室加1640 培養(yǎng)液（含10%FBS）500 μL，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS沖洗后甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，選10 個(gè)視野在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)并計(jì)算均值。

1.6 小鼠結(jié)腸癌皮下瘤模型的建立 將濃度為1×106個(gè)/mL 的CT26 細(xì)胞于小鼠背部皮下注射皮丘，劑量為0.5 mL。每5日測(cè)量一次腫瘤體積來觀察腫瘤大小，計(jì)算公式為腫瘤體積=腫瘤寬度2×腫瘤的長(zhǎng)度×0.52。當(dāng)小鼠腫瘤體積大約為150 mm3時(shí)，荷瘤小鼠模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程[7]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.7 小鼠分組及治療 將24 只BALB/c 小鼠結(jié)腸癌皮下瘤模型隨機(jī)分為3 組，每組8 只。對(duì)照組給予100 μL PBS，5-FU組給予腹腔注射20 mg/kg的5-FU，PEDF+5-FU組給予同時(shí)靜脈注射12.5 mg/kg的PEDF 蛋白和腹腔注射20 mg/kg 的5-FU 注射液。隔日給藥，共給藥3 次。給藥后第20天處死荷瘤小鼠，手術(shù)游離腫瘤組織后放入10%甲醛溶液中固定，病理組織切片后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 CD31免疫熒光染色檢測(cè)腫瘤組織微血管密度取出腫瘤組織冰凍組織切片，室溫下放置30 min后，用0.5% TritonX-100（PBS 稀釋）通透20 min。將切片置于濕盒中（保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài)），滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。將封閉液吸干后，滴加適當(dāng)比例稀釋的抗CD31 單克隆抗體（一抗，1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜。PBS清洗3次，5 min/次。加入熒光標(biāo)記的二抗（1∶1 000），37 ℃避光孵育30 min。PBS 清洗3 次，5 min/次。用DAPI 復(fù)染腫瘤細(xì)胞核5 min，PBS 清洗3 次，用防熒光淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的表達(dá)并采集圖像，使用Image J 5.0 軟件定量分析相同視野下CD31 免疫熒光的數(shù)量，從而間接測(cè)定微血管的生成密度。

1.9 TUNEL染色觀察腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況 準(zhǔn)備好腫瘤標(biāo)本石蠟切片，脫蠟至水，PBS 洗滌3 次，根據(jù)TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察。在5個(gè)隨機(jī)區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選擇的視野中的呈現(xiàn)出綠色熒光的凋亡細(xì)胞核數(shù)量進(jìn)行定量。通過凋亡細(xì)胞/腫瘤組織細(xì)胞的比值計(jì)算凋亡率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組CT26 細(xì)胞遷移能力的比較 與對(duì)照組相比，5-FU組和PEDF+5-FU組CT26細(xì)胞遷移能力顯著降低（P＜0.05）；與5-FU組相比，PEDF+5-FU組細(xì)胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），見圖1、圖2。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力

圖2 Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力（標(biāo)尺=50 μm）

2.2 荷瘤小鼠腫瘤體積和體重的變化 與對(duì)照組相比，5-FU 組和PEDF+5-FU 組腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05）；與5-FU組相比，PEDF+5-FU組抑制效果更加明顯（P＜0.05）。通過每5 天對(duì)荷瘤小鼠體重測(cè)量1次來評(píng)價(jià)小鼠毒副反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，3組荷瘤小鼠體重未見明顯差異（P＞0.05），見圖3。3組小鼠習(xí)性均無(wú)特殊改變，無(wú)意外死亡。

圖3 3組小鼠腫瘤體積和體重變化

2.3 腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)的情況 CD31免疫熒光染色檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度，CD31為內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抗原，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面。如圖4所示，PEDF+5-FU組微血管數(shù)量較對(duì)照組和5-FU 組明顯減少（P＜0.01），而對(duì)照組和5-FU組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 免疫熒光檢測(cè)各組CD31的表達(dá)（標(biāo)尺=50 μm）

2.4 組織中腫瘤細(xì)胞凋亡的情況 5-FU組和PEDF+5-FU組綠色熒光著色的細(xì)胞核明顯多于對(duì)照組，表明凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P＜0.05），且PEDF+5-FU 組細(xì)胞凋亡率高于5-FU 組（P＜0.05），見圖5。

圖5 TUNEL法免疫熒光染色法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的腫瘤之一，經(jīng)過多年的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，雖然取得了一定的研究成果，但結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，但臨床已經(jīng)證實(shí)其病因是多因素的，如肥胖、吸煙、飲食習(xí)慣和家族癌癥遺傳都是增加患癌的風(fēng)險(xiǎn)因素，目前的治療策略仍然是以化療和手術(shù)為主。其中5-FU 是針對(duì)消化道腫瘤的一個(gè)重要的化療藥物。

5-FU在體內(nèi)先降解成氟尿嘧啶脫氧核苷酸，從而發(fā)揮效應(yīng)影響DNA合成，也能在體內(nèi)降解為氟尿嘧啶核苷干擾RNA 合成，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成[8]。由于5-FU是根據(jù)人為合成的抗代謝類藥物，并在臨床上取得了良好的成效，尤其是對(duì)消化道腫瘤有良好治療效果，在腫瘤內(nèi)科化療應(yīng)用較為廣泛[9]。

但是單純的化療藥物總是會(huì)出現(xiàn)各種副反應(yīng)，隨著腫瘤的耐藥常常會(huì)對(duì)早期的良好治療效果產(chǎn)生一定影響，所以腫瘤治療過程中需要有新的思路?？寡苌莎煼ㄊ怯袕V闊前景的近年來興起的腫瘤治療策略之一。腫瘤組織的生存也必需依賴新生血管形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間存在相互調(diào)節(jié)作用。所以，如何將血管生成抑制劑同傳統(tǒng)化療藥物共同協(xié)同作用治療腫瘤，從而阻斷腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)的血供來源而產(chǎn)生殺滅腫瘤，進(jìn)一步增強(qiáng)傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的殺傷作用，是筆者需要思考的課題。

本研究通過體外劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，5-FU 組和PEDF+5-FU 組CT26細(xì)胞的遷移能力顯著降低（P＜0.05）。為了評(píng)價(jià)PEDF+5-FU藥物在小鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤的治療作用，本研究建立了結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5-FU 組和PEDF+5-FU 組內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的速率明顯減緩（P＜0.05），且PEDF聯(lián)合5-FU對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)抑制的效果更加明顯（P＜0.05）。CD31 免疫熒光染色提示，PEDF+5-FU 組腫瘤組織中的微血管數(shù)目較對(duì)照組及5-FU 組明顯減少。TUNEL 凋亡檢測(cè)結(jié)果提示，5-FU 組和PEDF+5-FU組綠色熒光著色的細(xì)胞核明顯多于對(duì)照組，表明凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且PEDF+5-FU組凋亡細(xì)胞最多（P＜0.05）。以上研究結(jié)果均提示PEDF聯(lián)合5-FU在體內(nèi)發(fā)揮較好的協(xié)同治療作用。

研究表明，PEDF 在腫瘤的表達(dá)水平與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[10]。在體內(nèi)主要是通過抑制腫瘤血管新生從而造成腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足，進(jìn)而出現(xiàn)凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)利用CD31 在新生血管中特異性表達(dá)，故而間接測(cè)定微血管的生成密度。Filleur等[12]分析了PEDF的分子結(jié)構(gòu)并確定了一個(gè)潛在的表面受體結(jié)構(gòu)域。此外，Abe 等[13]通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立PEDF 過表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)顯示被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞增殖率明顯下調(diào)。因此，PEDF 在體內(nèi)和體外同時(shí)具有促使腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，在本實(shí)驗(yàn)中也觀察到腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)凝聚和核碎裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。兩種藥物的聯(lián)合治療可以在保證治療效果的前提下減少化療藥物的劑量，進(jìn)而降低藥物的毒副反應(yīng)。本研究證實(shí)了將抗血管生成治療藥物與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以在體內(nèi)、體外均起到協(xié)同抗腫瘤的作用。

綜上所述，PEDF 在5-FU 的基礎(chǔ)上可抑制結(jié)腸癌組織周圍血管的生成，增加腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療腫瘤的作用。