張良兵，操禮瓊，董 巍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶市第一人民醫(yī)院， 安徽 安慶 246003)

電針是目前改善腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能障礙的重要補(bǔ)充手段，以改善中風(fēng)后遺諸癥[1-2]。有數(shù)據(jù)證實(shí)電針與有氧運(yùn)動(dòng)可協(xié)同改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損癥，但其作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論。有學(xué)者[3]證實(shí)腦組織細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA通路的活化是修復(fù)神經(jīng)元功能的靶點(diǎn)，更有研究人員[4]將cAMP/PKA通路作為非影像學(xué)標(biāo)志軸突再生的指標(biāo)。本研究通過(guò)觀(guān)察腦組織超微結(jié)構(gòu)及cAMP、PKA蛋白表達(dá)變化，結(jié)合實(shí)驗(yàn)性大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，旨在探討電針結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)改善腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 選用SPF級(jí)成年雄性SD大鼠[初始體重(220±20)g]92只，由中國(guó)上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[合格證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005],于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)，體重達(dá)(280±20)g進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。食物和水在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由動(dòng)物自由索取。實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理制度和使用委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，嚴(yán)格按照國(guó)際道德準(zhǔn)則和國(guó)家健康指南關(guān)于維護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)條例進(jìn)行處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 試劑及儀器 TTC染液、PMSF、SDS-PAGE電泳膠、BCA工作液(碧云天公司，中國(guó))，PKA ELISA試劑盒(CST公司，美國(guó))，DAPI染色液(CST公司，美國(guó))，cAMP、β-actin一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔(Promega公司，美國(guó))等。

電針儀(G6805，中國(guó)上海醫(yī)療儀器廠(chǎng))，小動(dòng)物跑臺(tái)(軟隆科技，中國(guó))，高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher，美國(guó))，切片機(jī)(Leica，德國(guó))，激光共聚焦熒光顯微鏡(Bio-rad，美國(guó))，透射電鏡(TACHI，日本)酶標(biāo)儀(Leica，德國(guó))，電泳槽(Bio-rad，美國(guó))，轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 本研究共分五組，將SD大鼠進(jìn)行兩次隨機(jī)，第1次分組：以1∶4 的比例用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分配空白組18只和造模組74只；第2次分組：根據(jù)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，將腦缺血造模失敗大鼠剔除(本實(shí)驗(yàn)造模成功72只大鼠，成功率97.3%)，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分配分為模型組18只、電針組18只、有氧運(yùn)動(dòng)組18只、電針+有氧運(yùn)動(dòng)組18只，分別于干預(yù)后7 d留取標(biāo)本。

1.4 模型制備 接受模型制備的大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后將大鼠呈仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)架上，剔除頸部毛發(fā)，常規(guī)消毒術(shù)野區(qū)域，沿著頸部正中線(xiàn)剪開(kāi)皮膚，鈍性分離充分暴露左頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，從ECA尾端沿著ICA緩慢插入線(xiàn)栓至左側(cè)大腦中動(dòng)脈入口，造成供血區(qū)急性缺血，固定線(xiàn)栓后逐層縫合皮膚，常規(guī)消毒，2 h后拔出線(xiàn)栓形成缺血再灌注。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 有氧運(yùn)動(dòng)：本研究中的有氧運(yùn)動(dòng)采用跑臺(tái)訓(xùn)練方式進(jìn)行，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參考文獻(xiàn)[4]，具體運(yùn)動(dòng)過(guò)程如下：大鼠于每日8∶00開(kāi)始進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)坡度設(shè)置為0°，先將大鼠以10 m/min速度訓(xùn)練15 min以便大鼠熟悉跑臺(tái)環(huán)境，隨后以20 m/min的速度運(yùn)動(dòng)30 min，連續(xù)訓(xùn)練7 d。訓(xùn)練結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行急性腦梗死模型制備。判斷力竭標(biāo)準(zhǔn)[4]：大鼠訓(xùn)練出現(xiàn)動(dòng)作僵硬吃力，80%以上的訓(xùn)練時(shí)間呈半臥位跑，降低跑臺(tái)速度后大鼠體力未恢復(fù)，對(duì)外界刺激反應(yīng)明顯遲鈍。

1.5.2 電針治療：造模24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行電針干預(yù)，先將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)架上，參照李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中曲池穴、足三里穴定位，將30#1寸不銹鋼毫針快速刺入上述穴位，進(jìn)針深度2 mm，接上 G6805 電針儀，電壓峰值為6 V，以針體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率1～20 Hz，每次電針 30 min，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.6 觀(guān)察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)：造模24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法參照Bederson等的5級(jí)分類(lèi)法，具體評(píng)分內(nèi)容如下：造模后大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀(0分)；提尾時(shí)大鼠右前肢屈曲，伸展不充分(1分)；提尾時(shí)大鼠右前肢屈曲，置于地面時(shí)向右側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力低于對(duì)側(cè)(2分)；提尾時(shí)大鼠右前肢屈曲，步行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈(3分)；造模后意識(shí)不清，甚至死亡(4分)。

1.6.2 TTC染色：干預(yù)后每組隨機(jī)選取3只大鼠，腹腔注射10%是水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后脫頸處死，冰上快速將腦組織取出后置于-20 ℃冰凍30 min，用鋒利刀片將腦組織冠狀位方向平均切成5片，每片約2 mm，將腦片置于TTC溶液中，避光染色30 min，期間依照著色程度對(duì)腦片進(jìn)行翻動(dòng)。正常腦組織經(jīng)過(guò)TTC溶液著色后呈現(xiàn)鮮紅色，梗死區(qū)域呈蒼白色。染色結(jié)束后利用高清掃描儀對(duì)腦片進(jìn)行掃描，Image J軟件對(duì)梗死區(qū)域大小進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。腦梗死體積=腦梗死面積×2 mm/全部腦片體積×100%。

1.6.3 透射電鏡觀(guān)察缺血半暗帶超微結(jié)構(gòu)：干預(yù)后每組隨機(jī)選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后腹腔注射4%多聚甲醛對(duì)腦組織進(jìn)行灌流固定，冰上快速取出缺血半暗帶，將組織修切成大小約1 mm3置于后2.5% 戊二醛磷酸緩沖液中24 h，隨后將樣本置于0.1 mol/L 的磷酸緩沖液漂洗3次，5 min/次，再進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋后烘干，再制成60 mm的薄切片，充分干燥后透射電子顯微鏡下觀(guān)察缺血半暗帶的超微結(jié)構(gòu)。

1.6.4 ELISA檢測(cè)外周血cAMP、PKA濃度：干預(yù)后每組隨機(jī)選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后取腹主動(dòng)脈血10 ml，4 ℃條件下進(jìn)行3000 g離心5 min后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。利用0.05 mol/L的碳酸鹽包備緩沖液將樣本稀釋至蛋白質(zhì)含量5 μg/ml，將96孔板中的反應(yīng)孔中加入0.1 ml，4 ℃靜置5 h后摒棄反應(yīng)孔溶液，用洗滌緩沖液洗滌反應(yīng)孔，再將待測(cè)樣本加入反應(yīng)孔中，室溫下靜置60 min后再次洗滌反應(yīng)孔，分別加入酶標(biāo)抗體、TMB底物后室溫下靜置30 min，再加入2 mmol/L的硫酸靜止反應(yīng)后將反應(yīng)孔置于MTT酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)。以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 見(jiàn)表1。造模24 h后，除空白組外，其余四組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均升高(P<0.05)，且四組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，說(shuō)明本研究的造模是成功的；經(jīng)干預(yù)7 d，電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組、電針+有氧運(yùn)動(dòng)組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均較治療前及模型組有所下降(P<0.05)；且電針+有氧運(yùn)動(dòng)組的神經(jīng)行為學(xué)的改善程度明顯大于電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(分)

2.2 各組大鼠腦梗死體積的比較 干預(yù)7 d，與空白組比較，模型組、電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組、電針+有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠的腦組織均出現(xiàn)不同程度的梗死灶(P<0.05)；與模型組比較，電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組、電針+有氧運(yùn)動(dòng)組的腦梗死體積百分比下降(P<0.05)，且電針+有氧運(yùn)動(dòng)組下降程度大于電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A：各組大鼠腦組織TTC染色情況(n=4)；B：各組大鼠腦梗死體積比較；與空白組比較，*P<0.05；

2.3 各組大鼠缺血半暗帶組織超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡提示空白組大鼠缺血半暗帶的神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)完整的細(xì)胞膜及細(xì)胞器、飽滿(mǎn)的細(xì)胞核，模型組大鼠腦組織見(jiàn)排列紊亂的神經(jīng)元、溶解的細(xì)胞器，且無(wú)法識(shí)別，與模型組比較，電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組及電針+有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善，細(xì)胞膜、細(xì)胞器及細(xì)胞核完整度明顯改善，且電針+有氧運(yùn)動(dòng)組優(yōu)于電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組(圖2)。

圖2 各組大鼠缺血半暗帶腦組織超微結(jié)構(gòu)比較(n=4，×15000)

2.4 各組大鼠外周血PKA蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組大鼠血清cAMP、PKA蛋白表達(dá)模型組下降(P<0.05)，經(jīng)治療7 d后，電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組及電針+有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠血清cAMP、PKA蛋白表達(dá)均增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但電針+有氧運(yùn)動(dòng)組的cAMP、PKA蛋白表達(dá)均高于電針組、有氧運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。

表2 各組大鼠外周血PKA蛋白表達(dá)比較(pg/ml)

3 討 論

腦梗死以其高致死率、高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)成為臨床研究重點(diǎn)[5]，隨著醫(yī)療水平日益提升，腦梗死患者的生存率及發(fā)病率得到明顯改善，但其遺留的運(yùn)動(dòng)功能障礙仍是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[6-7]。研究表明有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腦神經(jīng)有良好的保護(hù)效應(yīng)[8]，有氧訓(xùn)練可以從行走能力、姿勢(shì)反射、肌力、平衡功能等角度促進(jìn)腦梗死癱瘓肢體的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，本研究結(jié)果顯示有氧訓(xùn)練可明顯降低MCAO模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，縮減其腦梗死體積，這一研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)所得數(shù)據(jù)一致。

針灸作為目前臨床重要的中醫(yī)治療手段被廣泛應(yīng)用于改善腦梗死的功能障礙[9-10]?！鹅`樞·口問(wèn)》中云：“夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于府藏，外絡(luò)于支節(jié)”，認(rèn)為刺激特定的穴位可將全身上下、內(nèi)外、前后、左右形成一個(gè)有機(jī)整體，從而直達(dá)病所。曲池穴是手陽(yáng)明大腸經(jīng)合穴，清代吳謙在其《醫(yī)宗金鑒》中寫(xiě)道：“曲池主治中風(fēng)是”；《針灸資生經(jīng)》亦明確“刺風(fēng)疹疼痛冷緩，捉物不得，挽弓不開(kāi)，屈身難隱，脈風(fēng)臂肘細(xì)無(wú)力”，可見(jiàn)歷代醫(yī)家均肯定了曲池穴在治療腦卒中引起的運(yùn)動(dòng)障礙中的作用。足三里乃足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，陽(yáng)明經(jīng)多氣多血，刺激足陽(yáng)明胃經(jīng)可調(diào)暢氣血、扶助正氣。《針灸逢源》：“半身不遂：此由氣血不周……百會(huì)、肩井、肩髃、曲池、手三里、 列缺、風(fēng)市、絕骨、足三里。以上穴，先針無(wú)病手足，后針有病手足”[11-12]?？梢?jiàn)刺激曲池穴、足三里穴是促進(jìn)腦梗死后肢體功能恢復(fù)的特定穴。本研究亦發(fā)現(xiàn)電針上述穴位后大鼠運(yùn)動(dòng)能力較前改善，缺血半暗帶的超微結(jié)構(gòu)亦在一定程度上得到修復(fù)，可見(jiàn)曲池穴、足三里穴、可作為腦梗死后康復(fù)治療的重要組成部分，且我們還發(fā)現(xiàn)大鼠在進(jìn)一步接受電針聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后神經(jīng)功能修復(fù)程度更為凸顯，由此可見(jiàn)電針聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能障礙的改善確有協(xié)同效應(yīng)。

大量實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)cAMP廣泛參與神經(jīng)元突觸相關(guān)物質(zhì)的合成、傳遞等環(huán)節(jié)，對(duì)神經(jīng)元存活及軸突生長(zhǎng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13-15]。內(nèi)源性或外源性的刺激引起特定部位神經(jīng)元細(xì)胞的興奮性增加，從而釋放神經(jīng)遞質(zhì)，由此導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶AC的活化，AC被激活后可將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，由此使得特定部位cAMP水平增加，隨后促使更多的cAMP與PKA調(diào)節(jié)亞基相結(jié)合[16-18]，由此PKA結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，使得催化亞基PKAc解離后發(fā)生核移位，進(jìn)入細(xì)胞核的PKAc誘發(fā)CREB發(fā)生磷酸化，由此引起pCREB蛋白構(gòu)象產(chǎn)生變化致其酸性增強(qiáng)，隨后引起負(fù)電荷增多，據(jù)目前研究可知與DNA相結(jié)合的組蛋白均帶有正電荷，由此在正負(fù)電荷相吸下pCREB與DNA上組蛋白大量結(jié)合，由此DNA從組蛋白上分離出來(lái)，故組蛋白對(duì)DNA的抑制效應(yīng)被解除，從而促使DNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19-20]。本研究我們發(fā)現(xiàn)腦梗死發(fā)生后大鼠腦組織的cAMP、PKA濃度減少，可見(jiàn)當(dāng)腦組織急性缺血時(shí)該通路被抑制，隨著電針聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)的介入，cAMP、PKA表達(dá)明顯上調(diào)，提示電針聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)激活了cAMP/PKA通路，促進(jìn)缺血神經(jīng)功能的修復(fù)，適應(yīng)腦組織內(nèi)環(huán)境的變化。

由此可見(jiàn)電針聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)可激活腦組織cAMP/PKA通路，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)效應(yīng)。