周呈義 周國旗 劉振峰 鄒玉剛 鄒麗 陸小鳳 曾靜 羅先躍

1遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院）核醫(yī)學科563000；2遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科563003

重癥社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)是ICU收治的常見疾病,自20世紀50年代抗菌素發(fā)明以來CAP雖然得到很好的治療,但是重癥CAP的高病死率一直未得到改善,仍保持在20%～50%[1]。即使近些年來抗生素發(fā)明和生命支持方法得到不斷進步,但重癥CAP高病死率的現(xiàn)狀仍沒有得到改變。越來越多的研究認為合適的免疫調節(jié)聯(lián)合抗生素治療可能會提高重癥CAP的治療效果和預后。固有免疫是機體抵抗病原體侵犯的第一道防線,而相應的免疫受體及通路在固有免疫中發(fā)揮著重要作用,這些受體包括Toll樣受體家族、核苷酸結合和寡聚化結構域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)等。NLRP3炎癥小體是NLRs家族成員的組成之一,現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實其與凍傷蛋白相關周期性發(fā)熱綜合征、痛風、糖尿病、牛皮癬、HIV-易感性增加、炎癥性腸病等有關[2]。近來的研究表明NLRP3炎癥小體的活化與某些肺部感染常見病原體有關,但缺少相關的臨床研究。因此,本研究擬通過觀察CAP患者痰液及外周血單核細胞NLRP3炎癥小體及相關炎癥介質的表達,為臨床有效防治重癥CAP提供免疫學理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究經(jīng)倫理委員會同意后,隨機選取2018年4月至2019年4月于遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科住院的CAP患者20例,其中普通CAP患者12例,男9例(75.0%),女3例(25.0%),平均年齡(60.8±11.2)歲；重癥CAP患者8例,男4例(50.0%),女4例(50.0%),平均年齡(66.3±9.5)歲。另外選取同期于遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院體檢的健康人群10名作對照,男6名(60.0%),女4名(40.0%),平均年齡(61.0±7.7)歲。健康對照組個體的排除標準:自身免疫疾病、人免疫缺陷病毒感染、腫瘤、懷孕、其他感染性疾病或肺部疾病。CAP的診斷標準[3]為在胸部影像學提示急性肺部浸潤的基礎上合并以下條件中的至少2項:(1)呼吸道癥狀,如咳嗽、咳痰等；(2)感染中毒癥狀,如畏寒、發(fā)熱等；(3)肺部異常體征,如濕性啰音；(4)炎癥指標異常(如白細胞計數(shù)、C反應蛋白增高等)。利用ATS/IDSA 2007標準識別重癥CAP,重癥CAP入選標準[3]:(1)需要有創(chuàng)機械通氣；(2)感染性休克需要血管收縮劑治療。CAP的排除標準:自身免疫性疾病,HIV感染,惡性腫瘤,懷孕,醫(yī)院獲得性肺炎,或者感染性疾病。收集所有研究對象的一般資料,同時進行APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分判斷患者器官功能、病情嚴重程度。

1.2 主要試劑和儀器 主要儀器設備:NIKON光學顯微鏡購自日本NIKON公司,XW-80A型漩渦混合器購自精科公司,超凈工作臺購自蘇州凈化公司,垂直電泳槽購自上海儀器總廠,電泳儀購自美國Bio-Rad公司,電泳電轉系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,低溫離心機購自德國Backman,轉移槽DYCP-40C購自上海儀器總廠,恒溫箱購自德國ZEEnit700,IP Win32采圖系統(tǒng)購自美國Syngene公司,凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,PCR儀購自美國Bio-Rad公司。主要試劑:Histopaque-1077液購自美國Sigma公司,淋巴細胞分離液購自寶生物工程(大連)有限公司,RPMI 1640購自美國BioWhittaker公司,兔抗人NLRP3抗體、兔抗人IL-1β抗體和兔抗人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體購自美國SANTA公司,PCR引物購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 標本的獲取

1.3.1 血液標本的獲取 在住院第1天、第3天和出院日抽取重癥CAP、普通CAP患者外周靜脈血,健康對照組抽取同期健康體檢者的外周靜脈血,所有的血液標本均在7∶00和14∶00之間抽取2份,每份5 ml。1份加入等體積Histopaque-1077(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)液,混勻后室溫下600 r/min離心20 min(離心半徑為10 cm),按濃度梯度吸出單個核細胞層的細胞,用RPMI 1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)洗2次,純化的單核細胞分離后立即進行RT-PCR定量檢測；另一份行依地酸二鈉抗凝,4℃條件下1 200 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm),血漿于－20℃保存,用于蛋白質印跡檢測。

1.3.2 痰液標本的獲取 收取重癥CAP及普通CAP患者住院期間下呼吸道合格痰液(每低倍鏡視野下＜25個鱗狀上皮細胞,每高倍鏡視野下＞25個白細胞),健康對照組采取高滲鹽水誘導排痰收集,從痰液中分離痰栓,分為2份,1份稱重,按1 g加入4 ml 0.1%的二硫蘇糖醇攪拌混勻過濾,過濾液加入同體積的磷酸鹽緩沖液,4℃條件下1 500 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm),懸浮細胞備用蛋白質印跡檢測。

1.4 PCR檢測 利用逆轉錄PCR檢測外周血單核細胞中的NLRP3 mRNA表達,將1μg單核細胞RNA進行逆轉錄成DNA,然后進行擴增。使用正向引物5'-AAAAGACTCATCCGTGTGCC-3'和反向引物5'-TTCCTGGCATATCACAGTGG-3'檢測外周血中單核細胞的NLRP3 mRNA表達。同時使用正向引物5'-GGTCTTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'和反向引物5'-GACCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3'測定每個樣品中GADPH m RNA的水平。在1%瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物,并在透照儀上拍攝數(shù)碼照片。

1.5 蛋白質印跡檢測 利用蛋白質印跡檢測痰液細胞和外周血單核細胞NLRP3、IL-1β和TNF-α蛋白表達。主要步驟:(1)標本獲取,清洗后放入液氮中保存待檢測；(2)蛋白提取,將組織標本放入裂解液中解凍,利用Bradford法檢測蛋白濃度；(3)電泳及轉膜,將20 mg蛋白標本載入凝膠孔中進行凝膠電泳,條件為20 V 30 min,結束電泳后將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物上；(4)抗體孵育和檢測,先后用無標記的一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育、檢測。利用1.46版本Image J軟件對蛋白質印跡結果進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示,采用t檢驗進行比較；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示,采用非參數(shù)檢驗進行比較。計數(shù)資料以例數(shù)(百分數(shù))表示,采用χ2檢驗及Fisher確切概率法比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 結果顯示,重癥CAP組患者APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分均高于普通CAP組,同時重癥CAP組患者炎癥指標(C反應蛋白、降鈣素原)均高于普通CAP組；所有患者中有7例需要機械通氣,均為重癥CAP患者；另外,重癥CAP組治愈率明顯低于普通CAP組,且住院時間明顯增長。見表1。

表1 普通CAP組和重癥CAP組患者一般資料比較

2.2 蛋白質印跡 利用蛋白質印跡分別檢測痰液細胞的NLRP3、IL-1β和TNF-α表達,結果顯示:普通CAP組及重癥CAP組痰液細胞的NLRP3表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的NLRP3表達高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組及重癥CAP組痰液細胞的IL-1β表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的IL-1β表達高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組及重癥CAP組痰液細胞的TNF-α表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的TNF-α表達高于普通CAP組(P值均＜0.05)。見表2。

表2 各組痰液標本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；TNF-α為腫瘤壞死因子α；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 IL-1β TNF-α健康對照組 10 0.20±0.14 0.65±0.17 0.94±0.18普通CAP組 12 0.98±0.17a 0.85±0.21a 1.13±0.12a重癥CAP組 8 1.16±0.17ab 1.09±0.20ab 1.21±0.09ab F值 114.813 4.469 10.327 P值 ＜0.001 0.021 ＜0.001

利用蛋白質印跡分別檢測外周血單核細胞中的NLRP3、IL-1β和TNF-α表達,結果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3表達均高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3表達高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組外周血單核細胞中的IL-1β表達高于健康對照組(P＜0.05)；重癥CAP組外周血單核細胞中的TNF-α表達高于普通CAP組及健康對照組(P值均＜0.05)。見表3。

表3 各組外周血標本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達比較(±s)

表3 各組外周血標本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；TNF-α為腫瘤壞死因子α；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 IL-1β TNF-α健康對照組 10 0.66±0.51 0.44±0.19 0.36±0.18普通CAP組 12 1.23±0.25a 1.31±0.24a 0.45±0.16重癥CAP組 8 2.36±0.33ab 0.79±0.25 1.31±0.40ab F值 26.343 4.469 10.307 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 PCR檢測 利用RT-PCT檢測外周血單核細胞中的NLRP3 mRNA表達,結果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3 mRNA表達均高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3 m RNA表達高于普通CAP組(P值均＜0.05)。見表4。

表4 各組外周血單核細胞中NLRP3 m RNA表達比較(±s)

表4 各組外周血單核細胞中NLRP3 m RNA表達比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 m RNA健康對照組 10 0.31±0.35普通CAP組 12 0.46±0.65a重癥CAP組 8 0.64±0.78ab F值 21.429 P值 0.002

3 討論

CAP是全球急診科就診和住院治療的主要疾病之一,2014年美國急診科就診人數(shù)達423 000例。此外,重癥CAP患者需要較高的護理條件,例如進入ICU[4]。據(jù)估計,重癥CAP占所有ICU入院人數(shù)的6%,其中ICU死亡率為35%,整體院內(nèi)死亡率為50%[5]。CAP給社會造成了嚴重的經(jīng)濟負擔,并對患者造成了極大的死亡風險；因此,早期對重癥CAP識別和及時治療直接關系患者的預后。目前國際上已使用幾種常用的評分量化表對肺炎嚴重程度進行分類并評估住院需求,比如肺炎嚴重程度指數(shù)和CURB 65等量化指標。另外,ATS/IDSA 2007 CAP指南建議ICU入院的主要和次要標準,主要標準是需要機械通氣和需要血管加壓藥的感染性休克。這2個標準也反映了2個最相關的CAP并發(fā)癥:急性呼吸衰竭和敗血癥,這些都與高病死率有關。既往研究已經(jīng)表明NLRP3炎癥小體在肺癌、COPD等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[3],在除外慢性活動性肺部疾病以外的CAP患者較少,入選本研究的所有患者均達到所需標準,符合研究要求。

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御的第一道防線,其中種系編碼的模式識別受體活化對有害刺激(如病原體入侵、死細胞和環(huán)境刺激物等)的反應起到至關重要的作用[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的模式識別受體有5種,其具有核苷酸結合寡聚化結構域,包括NLR家族成員(如NLRP1、NLRP3和NLRC4),缺乏黑色素瘤2和pyrin等[7]。既往研究表明NLR家族中參與炎癥反應的有NLRC4、NLRX1、NLRP1、NLRP3、NLRP10等[2],其中對NLRP3的研究較多。經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活需要通過2種不同的信號,分別是啟動和激活信號:首先啟動信號增加前IL-1β和NLRP3轉錄,然后第二信號誘導其寡聚化,最終激活其生物學功能?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)闡明NLRP3能被多種刺激激活,如細胞外ATP[8]、石棉[9]和流感病毒[10],并參與許多疾病的發(fā)病機制[11]。近來的研究表明NLRP3信號與肺部疾病有明顯相關性,如該信號與重癥哮喘氣道炎癥反應程度有關[12],NLRP3炎癥小體的激活與病毒所致肺部損傷嚴重程度有關[13]。Witzenrath等[14]的研究表明NLRP3炎癥小體激活可能參與肺炎鏈球菌性肺炎的發(fā)生,但缺少相關的臨床觀察研究。本研究通過APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分等方法將試驗對象分為健康對照組、普通CAP組、重癥CAP組；利用蛋白質印跡檢測痰液細胞和外周血單核細胞的NLRP3表達發(fā)現(xiàn)普通CAP組及重癥CAP組患者痰液細胞的NLRP3表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的NLRP3表達高于CAP組；同時利用RT-PCT檢測外周血單核細胞中的NLRP3 m RNA表達,結果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3 m RNA表達高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細胞中的NLRP3 m RNA表達高于普通CAP組。因此,筆者推測NLRP3炎癥小體的表達可能與CAP的發(fā)生發(fā)展有關,并且可能與CAP的嚴重程度有關,需要以后大樣本的研究進一步證實。

NLRP3作為一種跨膜結構的受體分子[15],首先是機體免疫系統(tǒng)激活Toll樣受體后促進單核/巨噬細胞等通過核轉錄因子κB通路促進NLRP3和前IL-1β表達。然后是許多細胞事件的共同特征,膜滲透性或孔形成、溶酶體和線粒體損傷,以及活化氧產(chǎn)生等導致的K+外流可激活NLRP3炎癥小體[16]。最后,活化的NLRP3炎癥小體通過Caspase-1信號促進IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生,最終參與炎癥反應的發(fā)生。以上NLRP3信號通路已經(jīng)被證實不僅與肺部腫瘤性疾病有關[17],并且參與急性肺損傷的發(fā)病機制[18]。然而,目前尚未完全闡明NLRP3信號通路在CAP中的作用機制。本研究利用蛋白質印跡分別檢測痰液細胞和外周血淋巴細胞的IL-1β和TNF-α表達,結果顯示:普通CAP組及重癥CAP組痰液細胞的IL-1β表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的IL-1β表達高于普通CAP組；普通CAP組及重癥CAP組痰液細胞的TNF-α表達均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細胞的TNF-α表達高于普通CAP組。另外,普通CAP組外周血單核細胞中的IL-1β表達高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細胞中的TNF-α表達顯著高于普通CAP組及健康對照組。本研究不足之處有:(1)由于樣本量較小并不能分析出CAP中NLRP3炎癥小體的敏感性與特異性,以及與其他炎癥標志物的相關性；(2)由于既往研究證實NLRP3炎癥小體廣泛參與肺部疾病的發(fā)病機制,因此對肺部炎癥應該不具有特異性,尚不能作為肺部疾病鑒別的生物標志物,以上不足需以后大樣本、多中心的研究證實。

綜合以上研究結果可知,CAP患者NLRP3炎癥小體的表達增加,并且不同嚴重程度的CAP患者表達存在差異；同時,伴隨CAP患者炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達的變化。近來的研究表明[19]阻斷NLRP3可以減輕炎癥反應并減少病原體感染的機會。由此總結,NLRP3炎癥小體在CAP尤其重癥CAP中表達較高,推測NLRP3炎癥小體活化通路可能參與了CAP患者的炎癥反應及免疫調節(jié)過程。然而,具體的免疫調節(jié)機制及臨床意義需要進一步研究加以證實。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突