陶興罡，張志遠(yuǎn)

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，南昌 330006； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳淞醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200940)

慢性化膿性中耳炎(chronic suppurative otitis media，CSOM)是一種較為常見(jiàn)的耳科疾病，臨床上患者以耳痛、耳鳴、耳內(nèi)長(zhǎng)期反復(fù)間斷或持續(xù)性流膿、鼓膜穿孔、伴有或不伴有聽(tīng)力下降為主要臨床特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外很多研究者[1-4]對(duì)CSOM分離出的致病菌類型進(jìn)行了分析，各地區(qū)常見(jiàn)致病菌類型有所差異。隨著抗生素的使用，CSOM的致病菌譜及藥物敏感性也會(huì)隨之變化。而關(guān)于CSOM的毒力基因研究少有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究分析CSOM患者的細(xì)菌分型及藥物敏感性，并對(duì)相關(guān)致病菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，觀察病原菌譜和耐藥性的變化，為臨床合理治療CSOM提供用藥參考。

1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳淞醫(yī)院就診的CSOM患者166例患者(179只患耳)，男76例，女90例，年齡(49.31±12.44)歲，病程2個(gè)月～26年，平均21.2個(gè)月。

1.1 病例選取標(biāo)準(zhǔn)

1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性化膿性中耳炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②近期內(nèi)(5 d)未使用過(guò)抗菌藥物；③均為化膿性中耳炎活動(dòng)期。

2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除疾病，包括外耳道膽脂瘤、中耳膽脂瘤、中耳膽固醇肉芽腫、結(jié)核性中耳炎、中耳癌;②5 d內(nèi)使用過(guò)抗生素，包括滴耳液、口服、肌肉、靜脈。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器

由上海伊華醫(yī)學(xué)生物提供的血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色瓊脂培養(yǎng)基、沙保弱瓊脂培養(yǎng)基等，安圖MS1000質(zhì)譜儀、生物梅里埃公司的Vitec 2微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)和Vitec Densichek比濁儀。北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C電泳儀和DYCP-32B電泳槽用于蛋白電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 病原學(xué)和藥敏試驗(yàn)

按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[5]中耳分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)操作。用無(wú)菌棉簽采集門(mén)診或入院確診患者中耳鼓室分泌物，置于無(wú)菌試管中立即送檢，進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株應(yīng)用安圖MS1000質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

生物梅里埃公司的Vitec 2微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)和Vitec Densichek比濁儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法技術(shù)，藥敏試驗(yàn)方案參考全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)技術(shù)方案(CARSS網(wǎng)，http://www.carss.cn)，藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為2020抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)CLSI M100-30(中國(guó)藥師協(xié)會(huì)根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)合法授權(quán)翻譯印制)。

1.2.3 毒力基因測(cè)試

依據(jù)GenBank對(duì)外公布的毒力基因序列，采用Primer Premier 5引物軟件，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌毒力基因SEA、SEB、TSST-1、HLα、HLβ、PLV和銅綠假單胞菌毒力基因ToxA、ExoT引物。菌株采用酶解法，提取DNA，PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察。毒力基因引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，詳見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 致病菌種類分布

166例患者(179只患耳)的中耳分泌物標(biāo)本中，132例患者(143只患耳)培養(yǎng)出致病菌，檢出率為79.89%(143/179)。共培養(yǎng)出167株致病菌，其中24例患耳存在2種致病菌混合感染。

167株致病菌中，革蘭陽(yáng)性菌81株(占48.50%)，其中金黃色葡萄球菌50株(占29.94%)，凝固酶陰性葡萄球菌19株(占11.38%)；革蘭陰性菌22株(占13.17%)，其中銅綠假單胞菌12株(占7.19%)；真菌64株(占38.55%)，其中絲狀真菌44株(占26.35%)。見(jiàn)表2。

表2 致病菌分布及各自比例

表2(續(xù))

2.2 致病菌藥敏試驗(yàn)分析

對(duì)50株金黃色葡萄球菌和12株銅綠假單胞菌進(jìn)行耐藥分析。真菌未做藥敏試驗(yàn)。

金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素G的耐藥率最高為90.00%。耐藥率超30%的還有紅霉素(32.00%)和氨芐西林(30.00%)，見(jiàn)圖1。銅綠假單胞菌耐藥率最高的是環(huán)丙沙星(25.00%)和左旋氧氟沙星(25.00%)，見(jiàn)圖2。

圖1 金黃色葡萄球菌的耐藥情況(n=50)

圖2 銅綠假單胞菌的耐藥情況(n=12)

2.3 毒力基因

金黃色葡萄球菌的毒力基因SEA、SEB、TSST-1、HLα、HLβ、PLV中，HLα的檢出率最高，達(dá)100%；銅綠假單胞菌的毒力基因ToxA、ExoT中，ToxA的檢出率最高達(dá)100%，見(jiàn)表3。各毒力基因電泳結(jié)果見(jiàn)圖3—4。

表3 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌毒力基因檢出情況

1—24:金黃色葡萄球菌;M:marker。圖3 金黃色葡萄球菌各毒力基因電泳結(jié)果

圖3(續(xù))

1—6:銅綠假單胞菌;M:marker。圖4 銅綠假單胞菌各毒力基因電泳結(jié)果

3 討論

成年人CSOM的發(fā)病率在國(guó)內(nèi)一般為2%～4%[9]，占耳鼻喉科新診斷患者的11.7%。常合并慢性乳突炎，中耳腔內(nèi)的膿性分泌物以感染的細(xì)菌、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等為主，發(fā)病時(shí)間通常定義為8周以上。長(zhǎng)期的炎癥病理改變會(huì)破壞中耳的生理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聽(tīng)力損失，甚至破壞周圍的骨質(zhì)。在一定條件下，可出現(xiàn)嚴(yán)重的顱內(nèi)、外并發(fā)癥而危及生命[10]。感染、咽鼓管功能障礙及免疫不健全是中耳炎的三大主要發(fā)病病因[11]，致病菌感染是引起CSOM的最重要和最直接的外源性病因。

國(guó)內(nèi)外很多研究者對(duì)CSOM分離出的致病菌類型進(jìn)行了分析。上海的金曉杰等[1]研究62例CSOM患者的致病菌，依照實(shí)際的檢出占比為銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌等。楊燕珍等[2]收集武漢市92例CSOM患者的中耳炎性分泌物并做細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果致病菌是綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌等。王志紅等[3]收集化膿性中耳炎耳道分泌物80例進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果顯示，致病菌為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及銅綠假單胞菌等。韓國(guó)學(xué)者YEO等[4]回顧性分析1102名罹患CSOM患者致病菌排列為：假單胞菌屬、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌等。提示，CSOM的常見(jiàn)致病菌類型因地區(qū)而異。

本研究中凝固酶陰性葡萄球菌(頭狀葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耳葡萄球菌、假中間葡萄球菌等)占11.38%，因其致病性存在爭(zhēng)議[12]，故暫不作為致病菌參與比例排序。故排名前三位的致病菌檢出率為金黃色葡萄球菌50株(29.94%)、絲狀真菌44株(26.35%)、銅綠假單胞菌12株(7.19%)。與金曉杰等[1]在2004年提出的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的比例順序已完全不同。其中，金黃色葡萄球菌的檢出明顯增多，且真菌的檢出比例上升到第二位?？赡芘c上海處于我國(guó)的長(zhǎng)江下游地區(qū)，環(huán)境溫暖濕潤(rùn)，適合真菌生長(zhǎng)有關(guān)。另外，也可能與長(zhǎng)期不規(guī)范使用抗生素，造成局部菌群失調(diào)有關(guān)。本研究中24例患耳存在2種致病菌混合感染，可能是自行使用抗生素治療各種炎癥，造成局部或全身的菌群紊亂。

本研究總致病菌的耐藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，革蘭陽(yáng)性菌，特別是金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素G的耐藥率最高，遠(yuǎn)超《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》和《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》[13-14]的慎重用藥的標(biāo)準(zhǔn)，在金黃色葡萄球菌作為目標(biāo)細(xì)菌的治療中，建議暫停青霉素G。而耐藥率超30%的紅霉素、氨芐西林，也應(yīng)慎用。革蘭陰性菌，尤其是銅綠假單胞菌，對(duì)環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星的耐藥率最高，雖未達(dá)到用藥預(yù)警，但仍需注意目前對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類藥物的耐藥性，有明顯升高。參考“全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CARSS)”[15]，2019年金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性表中，耐藥率前五位與此次CSOM分離出金黃色葡萄球菌的耐藥率前五位的結(jié)果順序基本一致。2019年銅綠假單胞菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性表中，耐藥率前五位與此次CSOM分離出銅綠假單胞菌的耐藥率前五位結(jié)果順序基本相近。提示CSOM的致病菌，與全身其他部位的相同致病菌，對(duì)抗生素的耐藥效果基本相似。

細(xì)菌致病力的強(qiáng)弱，主要取決于其產(chǎn)生的各種毒力基因。此次實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的毒力基因中，HLα基因檢出率最高，達(dá)100%。HLα基因，是金黃色葡萄球菌分泌的外毒素——溶血毒素的α毒素，在感染致病過(guò)程中，具有破壞宿主細(xì)胞免疫屏障的能力，是關(guān)鍵因子之一，并參與金黃色葡萄球菌的生物膜生成[16]，與其致病性密切相關(guān)。而細(xì)菌生物膜在CSOM發(fā)病機(jī)制中已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注[17]。生物膜難以根除，還可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。此外，生物膜與受損組織，如暴露的骨組織和潰爛的中耳黏膜，或耳科植入物如鼓膜置管，緊密相連，進(jìn)一步加劇了治療困難[18]。

銅綠假單胞菌的毒力基因中，ToxA的檢出率最高，達(dá)100%。ToxA基因，由Ⅱ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生，其表達(dá)的外毒素，細(xì)菌毒力極強(qiáng)，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成障礙。因此，銅綠假單胞菌感染造成的CSOM，比其他致病菌更有致病性。

盡管各種毒力基因的檢出率各不相同，但是，這些毒力基因共同參與細(xì)菌的致病作用。例如，金黃色葡萄球菌的黏附和定植需要表面錨定蛋白和HLβ基因的參與，HLα、HLβ、PVL基因協(xié)同損傷細(xì)胞膜，HLα、HLβ基因共同降低纖毛功能，SEA、SEB基因發(fā)揮毒素效應(yīng)，TSST-1基因增強(qiáng)對(duì)毒素敏感性，共同參與CSOM的致病過(guò)程。而銅綠假單胞菌的ToxA和ExoT基因，則抑制靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞分裂，使細(xì)胞凋亡[19]和組織壞死。同樣將CSOM的致病力，發(fā)揮到了極致。

總之，隨著檢測(cè)方法的更新，治療藥物的升級(jí)，致病菌譜必定會(huì)有變化。因此，應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病原學(xué)的變化，及時(shí)總結(jié)致病菌檢出率的排序變化、細(xì)菌的耐藥率和耐藥特點(diǎn)等，并且更新使用針對(duì)性的抗菌藥物進(jìn)行治療。臨床盡可能對(duì)每位患者進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，特別是對(duì)抗菌治療效果差，或伴有糖尿病、結(jié)核病等消耗性疾病的機(jī)會(huì)性感染患者更是如此。依據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)結(jié)果，合理、規(guī)范、有針對(duì)性地使用抗生素，不僅可以縮短病程，減少并發(fā)癥，還可以減少耐藥性的發(fā)生。致病菌的培養(yǎng)鑒定、藥敏試驗(yàn)分析及其毒力基因的檢測(cè)，可為臨床合理用藥提供科學(xué)參考，進(jìn)一步促進(jìn)個(gè)體化治療，精準(zhǔn)化治療。同時(shí)，衛(wèi)生管理部門(mén)應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的管理，加大監(jiān)督和指導(dǎo)的力度；醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)嚴(yán)格控制對(duì)抗菌藥物的臨床應(yīng)用指征；應(yīng)該通過(guò)各種渠道宣傳濫用抗菌藥物的危害，增強(qiáng)遵守醫(yī)囑的自覺(jué)性，避免過(guò)度使用抗菌藥物。

致謝：特此感謝劉洋師兄對(duì)論文的悉心指導(dǎo)！