李俊健，黃劍釗，林錦銘，高杰賢，黎攀，杜冰

(華南農業(yè)大學 食品學院，廣州 510642)

淡豆豉(sojae semen praeparatum)是以豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子為主料，以青蒿、桑葉為輔料，經發(fā)酵加工而成的中藥，藥食同源，在中醫(yī)臨床上被用于治療寒熱頭痛、煩躁胸悶等癥狀[1]；現代科學研究表明，發(fā)酵大豆具有抗氧化、提高免疫力及抗疲勞等功效[2-4]。目前國內外對淡豆豉的研究多集中于其酶活、異黃酮及風味上[5-7]，研究表明，曲霉、枯草芽孢桿菌等發(fā)酵可提升淡豆豉中纖溶酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活性[8]；豆豉異黃酮已被證實具有較強的抗氧化損傷、抗癌等功效[9]；利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(HS-SPME/GC-MS)結合電子感官對淡豆豉發(fā)酵過程中的風味進行分析也是研究的一大熱點[10]。

血栓是心肌梗死、腦梗塞等致死性心血管疾病的共同發(fā)病機制，對人類健康危害極大[11-12]。從日本納豆中提取的納豆激酶是目前研究較多的新一代溶栓劑，其研究已經達到分子水平[13]，我國傳統(tǒng)中藥淡豆豉的發(fā)酵工藝與日本納豆類似，研究人員發(fā)現淡豆豉中也存在著溶栓酶[14]，該酶可以溶解血栓且溶栓效率比藥物還要高。但日本納豆以其獨特的風味和高溶栓酶活力早已風靡全球，淡豆豉的開發(fā)研究仍停滯在普通食品階段[15]，究其原因是中國淡豆豉在發(fā)酵過程中沿襲傳統(tǒng)的自然發(fā)酵模式，沒有進行大規(guī)模的純種發(fā)酵研究，導致產品質量不一，食品的安全性難以保證[16-17]。為解決發(fā)酵豆豉、豆醬等豆制品風味不佳的問題，使用多菌種復合發(fā)酵的方法被提出，結果表明霉菌、乳酸菌等菌種復合發(fā)酵不僅可以使豆制品的感官可接受度升高，還能提高其功能成分含量，成為提升豆制品品質的重要方法[18-21]。

本研究是在課題組前期已確定中國根霉12能被應用于淡豆豉的發(fā)酵并具有產高活性溶栓酶的基礎上[22-23]，把中國根霉12與乳酸芽孢桿菌DU-106、畢赤酵母搭配進行復合發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝開發(fā)出具有高溶栓酶活力的淡豆豉，并與市售的傳統(tǒng)工藝淡豆豉進行成分對比，研究結果有利于為復合發(fā)酵制作高溶栓酶活力淡豆豉提供參考。

1 材料與設備

黑豆：天地糧人有限公司；市售淡豆豉、桑葉、青蒿：均購于廣州南北行中藥飲片有限公司；纖維蛋白原(Sigma F-8630)、凝血酶(Sigma T-4648)：購于Sigma公司；尿激酶標準品(1240 IU/瓶)、蘆丁、染料木素、大豆苷元等標準對照品：購于中國藥品生物制品檢定所；乳酸芽孢桿菌DU-106：篩選于傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，菌粉濃度為1012CFU/g；中國根霉(Rhizopuschinesis)12、乳酸芽孢桿菌DU-106、畢赤酵母：均由華南農業(yè)大學新資源與功能性原料研究及評價中心鑒定及保藏；其他無機試劑均為分析純。

RXZ型人工氣候培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；DDC06TSL型低溫熱泵干燥箱、752-N型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；SKD-3000型全自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 安捷倫有限公司。

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵菌種的活化及擴大培養(yǎng)

取中國根霉12和畢赤酵母保藏菌種1～2環(huán)，接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，分別于恒溫培養(yǎng)箱中于32 ℃和28 ℃培養(yǎng)48 h后，接種培養(yǎng)好的菌種到擴大培養(yǎng)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，分別于32 ℃和28 ℃培養(yǎng)48 h，制得中國根霉12和酵母發(fā)酵種子液，備用。稱取0.1 g的乳酸芽孢桿菌DU-106菌粉加入到100 mL乳酸菌增殖液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12 h，制得乳酸芽孢桿菌DU-106種子液備用。

2.2 淡豆豉的制備工藝

黑豆→挑選→浸泡→蒸煮→冷卻→接種→發(fā)酵→干燥→成品。

挑選成熟、顆粒均勻飽滿、無腐爛蟲蛀的黑豆為原料；按《中國藥典》中淡豆豉炮制工藝進行浸泡，取桑葉90 g、青蒿100 g，加入水煎煮3 次后拌入1000 g黑豆浸泡12 h；將拌有藥汁浸泡預處理后的大豆隔水蒸煮一段時間，在一定發(fā)酵溫度下接入復合菌種：中國根霉12(接種量為15%，V/W)、乳酸芽孢桿菌DU-106(接種量為107CFU/g)和畢赤酵母(接種量為1%，V/W)發(fā)酵一定時間，40 ℃低溫熱泵干燥至水分≤8.0%后得到淡豆豉。

2.3 淡豆豉發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.3.1 黑豆蒸煮時間對淡豆豉溶栓酶活性的影響

將藥汁浸泡后的大豆分別隔水蒸0.5，1，1.5，2，2.5 h，冷卻后接入復合菌種在32 ℃下發(fā)酵7 d，測定溶栓酶活性，優(yōu)化蒸煮時間。

2.3.2 發(fā)酵時間對淡豆豉溶栓酶活性的影響

以實驗得到的蒸煮時間，在32 ℃恒溫培養(yǎng)箱下，探究不同發(fā)酵時間5，7，9，11 d下淡豆豉飲片的溶栓酶活性，優(yōu)化淡豆豉的發(fā)酵時間。

2.3.3 發(fā)酵溫度對淡豆豉溶栓酶活性的影響

以實驗得到的最優(yōu)蒸煮時間和最優(yōu)發(fā)酵時間，探究不同發(fā)酵溫度24，28，32，36，40 ℃下淡豆豉飲片的溶栓酶活性，優(yōu)化淡豆豉的發(fā)酵溫度。

2.4 淡豆豉溶栓酶活性的測定

2.4.1 牛纖維蛋白平板的制作

取25 mg牛纖維蛋白溶于10 mL PBS(pH 7.4)溶液中，現配現用；將平板置于水平桌面上，向平板中加入12 μL 100 U/mL的凝血酶溶液，再加入5 mL牛纖維蛋白溶液，輕輕轉動平板使兩種溶液混勻，混勻后加入5 mL 1.5%的瓊脂糖溶液，繼續(xù)轉動直至平板凝固，在室溫下靜置4 h以上，打孔進樣。

2.4.2 溶栓酶活性的測定

以尿激酶的活力單位表示溶栓酶活性；取尿激酶溶于PBS中制得100 μL濃度為1240 IU/mL的尿激酶溶液并按梯度稀釋，取10 μL系列尿激酶標準溶液打入到平板的圓孔內，在37 ℃培養(yǎng)18 h后，測量水溶圈的垂直直徑并繪制標準曲線。

取0.05 g樣品放入離心管中，加入1.5 mL PBS溶液使其充分溶解，在4 ℃冰箱中放置24 h后取出并搖勻，10000 r/min離心10 min，取上清液備用。吸取10 μL樣品溶液打入到平板的圓孔內，37 ℃培養(yǎng)18 h后，測量水溶圈的垂直直徑。將樣品水溶圈的垂直直徑乘積代入尿激酶標準曲線，得到每毫升樣品溶液的溶栓酶活性，再根據所配樣品溶液的濃度進行換算成每克樣品溶液的溶栓酶活性。

2.5 淡豆豉的品質評價

蛋白質按照GB 5009.5-2016凱氏定氮法測定[24]；氨基酸態(tài)氮按照GB 5009.235-2016酸度計法測定[25]；總黃酮按照陳怡等[26]的超聲輔助法結合硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定；大豆異黃酮按照GB/T 23788-2009中描述的方法進行測定[27]；還原糖按照GB 5009.7-2016直接滴定法測定[28]；黃曲霉毒素B1按照GB 5009.22-2016同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定[29]。

3 結果與分析

3.1 不同蒸煮時間對淡豆豉溶栓酶活力的影響

以溶解圈面積為橫坐標，溶栓酶活力單位對數為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線為：y=0.4809x+0.538，R2=0.9971，該標準曲線可信。

圖1 不同蒸煮時間對淡豆豉溶栓酶活力的影響Fig.1 Effect of different cooking time on thrombolytic enzyme activity of SSP

由圖1可知，在其他工藝參數相同的情況下，不同的蒸煮時間對淡豆豉的溶栓酶活性具有顯著影響，隨著蒸煮時間的增加，溶栓酶活性增加，蒸煮2 h的溶栓酶活性最高，達到8165.43 IU/g，進一步延長蒸煮時間，對溶栓酶活性無增加影響，后續(xù)實驗中黑豆均蒸煮2 h。

3.2 不同發(fā)酵時間對淡豆豉溶栓酶活力的影響

以溶解圈面積為橫坐標，溶栓酶活力單位對數為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線為：y=0.4456x+1.3394，R2=0.9963，該標準曲線可信。

圖2 不同發(fā)酵時間對淡豆豉溶栓酶活力的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on thrombolytic enzyme activity of SSP

由圖2可知，在黑豆蒸煮2 h，發(fā)酵溫度相同的情況下，不同的發(fā)酵時間對淡豆豉溶栓酶活性具有顯著影響，發(fā)酵7 d時溶栓酶活性最高，達到7152 IU/g，隨著發(fā)酵時間的增加，溶栓酶活性下降，后續(xù)實驗均發(fā)酵7 d。

3.3 不同發(fā)酵溫度對淡豆豉溶栓酶活力的影響

以溶解圈面積為橫坐標，溶栓酶活力單位對數為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線為：y=0.4934x+0.4709，R2=0.9952，該標準曲線可信。

圖3 不同發(fā)酵溫度對淡豆豉溶栓酶活力的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on thrombolytic enzyme activity of SSP

由圖3可知，在黑豆蒸煮2 h、發(fā)酵7 d的情況下，不同的發(fā)酵溫度對淡豆豉溶栓酶活性具有顯著影響，28 ℃發(fā)酵的淡豆豉溶栓酶活性最高，達到15530.98 IU/g，之后隨著溫度的升高，淡豆豉溶栓酶活力下降。發(fā)酵溫度過高不利于發(fā)酵菌種的生長及溶栓酶的產生，故發(fā)酵溫度選定為28 ℃。

淡豆豉的最優(yōu)制備工藝為黑豆蒸煮2 h，在28 ℃下發(fā)酵7 d，后續(xù)實驗中發(fā)酵淡豆豉均使用此制備工藝。

3.4 最優(yōu)工藝淡豆豉的評價及對比

3.4.1 不同淡豆豉樣品的理化指標對比

表1 不同淡豆豉樣品的理化指標測定Table 1 Determination of physicochemical indexes of various SSP samples

由表1可知，復合發(fā)酵得到的淡豆豉蛋白質含量與市售淡豆豉蛋白質含量相當，蛋白質含量分別為45.5，45.6 g/100 g。在豆豉發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮含量的變化可用來判斷產品蛋白質的水解程度，復合發(fā)酵得到的淡豆豉氨基酸態(tài)氮含量比市售淡豆豉的氨基酸態(tài)氮含量略少，發(fā)酵淡豆豉的氨基酸態(tài)氮含量為0.59 g/100 g，市售淡豆豉的氨基酸態(tài)氮含量為0.86 g/100 g。復合發(fā)酵淡豆豉的總黃酮含量比市售淡豆豉略低，發(fā)酵淡豆豉總黃酮含量為20.0 mg/100 g,市售淡豆豉總黃酮含量為25.7 mg/100 g。

無論是復合發(fā)酵的淡豆豉，還是市售傳統(tǒng)炮制工藝的淡豆豉，其還原糖含量都比較低，低于GB 5009.7-2016《食品安全國家標準》 食品中還原糖的測定中規(guī)定的檢測下限，推測是在發(fā)酵過程中微生物利用了黑豆中的還原糖作為碳源。在發(fā)酵淡豆豉中也未檢測到黃曲霉毒素B1，說明發(fā)酵得到的溶栓淡豆豉較為安全。

3.4.2 不同淡豆豉樣品的異黃酮含量對比

圖4 不同淡豆豉的異黃酮含量對比Fig.4 Comparison of isoflavone content in various kinds of SSP

由圖4可知，復合發(fā)酵淡豆豉中大豆異黃酮的含量比市售淡豆豉的含量要高，發(fā)酵淡豆豉的大豆異黃酮含量為3.03 mg/g，而市售淡豆豉的大豆異黃酮含量為1.88 mg/g，上升了1.15 mg/g。其中相對于傳統(tǒng)炮制工藝的市售淡豆豉，復合發(fā)酵可以明顯提高異黃酮中大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素的含量，但對大豆黃苷、大豆黃素無明顯影響。發(fā)酵淡豆豉的總異黃酮含量比市售淡豆豉高，其原因可能是發(fā)酵過程中微生物產生的β-葡萄糖苷酶等將黑豆中的糖苷型異黃酮轉化成為苷元型異黃酮，游離異黃酮含量上升，異黃酮含量的上升有助于提高豆豉的生物活性[30]。

4 結論

本研究以黑豆為發(fā)酵基質，采用中國根霉12、乳酸芽孢桿菌DU-106、畢赤酵母復合發(fā)酵菌種制備具有高溶栓活性的淡豆豉，最佳的發(fā)酵工藝為黑豆先蒸煮2 h，在28 ℃條件下發(fā)酵7 d，此工藝下制得的淡豆豉溶栓酶活性可達(15530.98±1832.4)IU/g；與市售淡豆豉相比，最佳發(fā)酵工藝的淡豆豉蛋白質含量相當，氨基酸態(tài)氮與總黃酮含量略有下降，異黃酮中的大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素明顯升高。應用復合發(fā)酵菌種經優(yōu)化工藝發(fā)酵的淡豆豉溶栓活性高，異黃酮類物質含量升高明顯；復合菌種發(fā)酵對提高淡豆豉的品質具有實際意義，可利用其繼續(xù)開發(fā)具有高溶栓活性的淡豆豉產品。