張海東 郭鴻儒 馮亞民 張 健 宮田嬌 楊淑芳

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132000)

蛹蟲草，又稱北蟲草，簡稱蛹草，屬子囊菌亞門(Ascomyxotinae)肉座目(Hypocreales)麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬[1]。蛹蟲草活性肽是一類具有抗氧化、增強(qiáng)免疫功能以及降血糖作用的小分子生物，但直接口服極易被生物體內(nèi)酶所分解，失去生物活性[2-4]。復(fù)相乳液法是指對于親水性藥物可以采用在 O/W 型溶劑揮發(fā)法基礎(chǔ)上改良的 W/O/W 型溶劑揮發(fā)法[5-6]。在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、日用化學(xué)品、生物制品化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7-10]。藥物首先溶解于內(nèi)水相中，然后藥物溶液加入油相中通過超聲或高速攪拌乳化形成 W/O 初乳，接著初乳加入外水相中，制成 W/O/W 復(fù)乳，最后得到微球，此種方法對于大分子親水性物質(zhì)能夠得到高藥品包封率,有效地保留了生物活性。

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提升，人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，與飲食相關(guān)的以高血糖、高血脂、高血壓為主的代謝性疾病—糖尿病的發(fā)病率逐年升高[11-13]。目前常用食療、口服降糖藥或胰島素治療糖尿病[14-15]。然而，傳統(tǒng)的雙胍類藥物和磺酰脲類有許多副作用，使部分患者無法進(jìn)行使用[16-17]。植物多糖來源廣泛且毒副作用小，針對于具有降血糖活性的植物多糖研究已成為生物技術(shù)及醫(yī)藥界的熱門話題[18-20]。本研究對蛹蟲草肽聚乳酸微囊作為治療糖尿病的功能性藥物進(jìn)行的研究，為其在生物、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

蛹蟲草：由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院提供。

蛹蟲草肽聚乳酸微囊：復(fù)相乳液法制得的蛹蟲草肽聚乳酸微囊。

鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；鹽酸二甲雙呱片，北京太洋藥業(yè)有限公司；

血糖試紙，長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；95%乙醇、濃硫酸、苯酚、正丁醇、氯仿均為分析純；甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(CHO)測定試劑盒、血清尿素氮(BUN)測定試劑盒、肝糖元測定試劑盒、胰島素(INS)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

昆明種小白鼠(體重18～22 g，雄性)：遼寧長生生物有限公司提供的清潔級實(shí)驗(yàn)動物。

1.2 研究方法

1.2.1 蛹蟲草肽聚乳酸微囊的制備

圖1

內(nèi)水相為多肽凍干粉的水溶液，油相為溶解了PLA的DCM溶液。將油相慢慢注入激烈攪拌著的內(nèi)水相中，并高速攪拌20 min，使其成為一個超細(xì)、均勻的W/O乳液。待均勻乳液形成后,將得到的乳液迅速冷卻到10 ℃左右，以增加W/O乳液本身的粘度。然后再將濃度為3.5% PVA溶液用注射器注入攪拌著的乳液中，低速低溫條件下繼續(xù)攪拌一定時間后，將該W/O/W乳液置于40 ℃的恒溫水浴中繼續(xù)攪拌，蒸發(fā)除去其中的DCM，1 h后停止加熱。待乳液冷卻后進(jìn)行離心分離。離心得到的固體用蒸餾水洗滌，再離心分離。最后將離心得到的固體置于表面皿上，真空冷凍干燥至固體粉末恒重為止。

1.2.2 一般狀態(tài)觀察

每天觀察動物1次，觀察各組間動物的精神狀況、行為和毛色的差異。給藥前稱體重，每周稱重并記錄動物體重1次。

1.2.3 多糖對血糖及糖耐量的影響

1.2.3.1 模型的建立

選擇健康雄性昆明小鼠，體重18～22 g，標(biāo)記，稱重，禁食12 h后按80 mg/(kg·bw)劑量腹腔注射鏈脲組菌素，連續(xù)注射3 d。72 h后，尾部靜脈取血，利用血糖儀對血糖進(jìn)行測定。選擇血糖值在11.1 mmol/L以上的小鼠進(jìn)行觀察，連續(xù)出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀的小鼠，視為糖尿病(DM)小鼠模型，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3.2 分組與處理

將建模成功的小鼠分成5組，每組8只，分別為：模型對照組、陽性對照組以及蛹蟲草肽聚乳酸微囊低劑量組、中劑量組、高劑量組，同時設(shè)置正常對照組。陽性對照組灌胃二甲雙胍組溶液200 mg/(kg·d)，各劑量組分別灌胃蛹蟲草肽聚乳酸微囊溶液100 mg/(kg·d)、200 mg/ (kg·d)和300 mg/(kg·d)，正常對照組、模型對照組每天灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃4周。

1.2.3.3 血糖的測定

將小鼠禁食12 h，尾部靜脈取血，利用血糖儀對血糖進(jìn)行測定。

1.2.3.4 糖耐量試驗(yàn)

連續(xù)給藥4周后，在第29天禁食12 h，空腹尾靜脈采血測血糖1次。然后給予1.11 mol/L葡萄糖體重灌胃，0.5 h、1 h和2 h后尾靜脈采血，利用血糖儀對血糖進(jìn)行測定。

計(jì)算公式：

曲線下面積(AUC)=0.5×空腹血糖值+0.5 h血糖值+1.5×1 h血糖值+2和血糖值

1.2.4 小鼠臟/體比的測定

解剖前對小鼠稱重記錄。動物摘眼球取血后，立即解剖，取肝臟、腎臟、脾臟和心臟置于低溫生理鹽水中清洗，用濾紙擦干后稱重，并記錄。

1.2.5 血清生化分析

1.2.5.1 TG的測定

a.檢測原理

脂肪酶分解血清中甘油三酯為甘油與脂肪酸。在ATP 存在下，甘油激酶將甘油磷酸化生成3-磷酸甘油。3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化生成磷酸二羥丙酮和過氧化氫。過氧化氫與過氧化物酶、4-氨基比林進(jìn)行顯色反應(yīng)，生成有色苯醌亞胺。生成醌類化合物顏色的深淺與甘油三酯的含量成正比。其反應(yīng)如下：

b.檢測步驟

血清樣本前處理：將新鮮血液置于室溫下，自然凝固10～20 min，離心(2 000～3 000r/min-1，5 min)。收集上清，置于低溫保存。測定前若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。后續(xù)操作按試劑盒說明進(jìn)行，具體操作如表1。

表1 加樣操作Ⅰ

c.計(jì)算公式

1.2.5.2 CHO的測定

a.檢測原理

膽固醇酯加水在膽固醇酯酶的作用下生成游離膽固醇和脂肪酸。游離膽固醇加氧在膽固醇氧化酶的作用下生成膽脘-4-烯-3-酮和過氧化氫，過氧化氫再加4-氨基氨替比林和酚在過氧化酶的作用下生成紅色的苯醌亞胺。其反應(yīng)如下：

b.檢測步驟

血清樣本前處理：將新鮮血液置于室溫下，自然凝固10～20 min，離心(2 000～3 000r/min-1，5 min)。收集上清，置于低溫保存。測定前若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。后續(xù)操作按試劑盒說明進(jìn)行，具體操作如表2。

表2 加樣操作Ⅱ

c.計(jì)算公式

1.2.5.3 BUN的測定

a.檢測原理

尿素在脲酶的作用下水解產(chǎn)生氨離子和二氧化碳，氨離子在堿性介質(zhì)中與酚顯色劑生成藍(lán)色的物質(zhì)，該物質(zhì)的生成量與尿素含量成正比。

b.檢測步驟

血清樣本前處理：將新鮮血液置于室溫下，自然凝固10～20 min，離心(2 000～3 000r/min-1，5 min)。收集上清，置于低溫保存。測定前若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。后續(xù)操作按試劑盒說明進(jìn)行，具體操作如表3。

表3 加樣操作Ⅲ

c.計(jì)算公式：

尿素氮含量(mmol/L)=

1.2.6 對肝糖原的影響

a.檢測原理

糖元在濃堿溶液中較穩(wěn)定，故肝組織先置濃堿中加熱，破壞蛋白質(zhì)及其他成分保留肝糖元，然后加酒精至60%使之沉淀析出并除去小分子有機(jī)物質(zhì)，以免后者在濃硫酸中炭化影響生色。糖原在濃硫酸中可先水解生成葡萄糖，然后進(jìn)一步脫水生成糠醛衍生物。后者和蔥酮作用，形成藍(lán)綠色化合物，與同法處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比色。

b.操作步驟

肝臟樣本前處理：準(zhǔn)確稱取肝臟組織重量(≤100 mg)，按肝臟重量(g)∶堿液體積(mL)=1∶3，一起加入試管中，沸水煮20 min，流水冷卻，得糖元水解液。按肝臟重量(g)∶蒸餾水體積(mL)=1∶96向糖元水解液中加入蒸餾水，進(jìn)一步制備成糖元檢測液。后續(xù)操作按試劑盒說明進(jìn)行，具體操作如表4。

表4 加樣操作Ⅳ

1.2.7 對胰島素的影響

a.原理

應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠胰島素(INS)水平。用純化的小鼠抗-胰島素(INS)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗體的微孔中依次加入胰島素(INS)，再與HRP標(biāo)記的胰島素(INS)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰島素(INS)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠胰島素(INS)濃度。

b.操作步驟

血清樣本前處理：將新鮮血液置于室溫下，自然凝固10～20 min，離心(2 000～3 000r/min-1，5min)。收集上清，置于低溫保存。測定前若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。后續(xù)操作按試劑盒說明進(jìn)行，具體操作如下。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 uL，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品50 uL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 uL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 uL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 uL棄掉，再各取50 uL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 uL，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 uL分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 uL，混勻后從第七、第八孔中各取50 uL分別加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 uL，混勻后從第九、第十孔中各取50uL棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50 uL，濃度分別為12 mU/L，8 mU/L，4 mU/L，2 mU/L，1 mU/L)。

加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔先加樣品稀釋液40 uL，然后再加待測樣品10 uL(樣品最終稀釋倍數(shù)為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。

配液：20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄掉液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 uL，空白孔除外。

溫育：再次用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。

洗滌：再次小心揭掉封板膜，棄掉液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

顯色：每孔先加入顯色劑A 50 uL,再加入顯色劑B 50 uL,輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15 min。

終止：每孔加終止液50 uL，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，各項(xiàng)指標(biāo)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間和組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以LSD法進(jìn)行組間的兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物生長狀況

在試驗(yàn)過程中，小鼠注射STZ后，毛色雜亂，行動遲緩，具出現(xiàn)明顯的“三多一少”的糖尿病癥狀。給藥治療4周后，與高血糖模型對照組相比，蛹蟲草肽聚乳酸微囊組小鼠的皮毛光澤，行動較為靈活，說明蛹蟲草肽聚乳酸微囊可使糖尿病小鼠的健康狀況呈現(xiàn)良好的狀態(tài)。

蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠體重的影響圖2-1。由圖2-1可知，建模后的小鼠體重明顯低于正常對照組的小鼠。建模后將小鼠按照體重及血糖水平狀況平均分組。4周后，正常對照組健康小鼠體重呈正常增長趨勢，模型對照組以及蛹蟲草肽聚乳酸微囊劑量組小鼠體重明顯低于正常對照組(P<0.01)，蛹蟲草肽聚乳酸微囊低、中、高劑量三組的小鼠體重與模型對照組相比無顯著差異。

圖2-1 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠體重的影響

2.2 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對小鼠血糖的影響

蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠血糖的影響如圖2-2所示。由圖2-2可知，建模后與正常對照組比較，糖尿病小鼠的血糖明顯升高，說明造模成功。給藥4周后，MCP 劑量組：100 mg/(kg·bw)、200 mg/(kg·bw)和300 mg/(kg·bw)的血糖濃度分別為(13.26±0.36)mmol/L、(10.88±0.78)mmol/L、(11.73±1.33)mmol/L，與給藥前相比，血糖濃度分別降低了18.60%、38.12%、27.99%，中劑量組的降糖效果最佳。陽性對照組降糖效果高于蛹蟲草肽聚乳酸微囊低劑量和高劑量組，降糖率達(dá)33.21%，但卻低于蛹蟲草肽聚乳酸微囊中劑量組。

圖2-2 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠血糖的影響

2.3 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對小鼠糖耐量的影響

糖耐量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-3和2-4所示。與模型對照組比較，陽性對照組與蛹蟲草肽聚乳酸微囊劑量組小鼠的血糖水平和血糖曲線下面積(AUC)均顯著降低(P<0.05)，說明蛹蟲草肽聚乳酸微囊有益于緩解糖尿病癥狀。

圖2-3 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對小鼠血糖的影響

圖2-4 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠糖耐量的影響

2.4 臟器/體重比例的變化情況

在試驗(yàn)終期，小鼠摘眼球取血后迅速解剖，取出臟器，濾紙擦干血跡后稱重。結(jié)果如圖2-5所示。與正常對照組相比，糖尿病模型小鼠肝/體和腎/體的比例明顯增加(P<0.05)，分別上升了16.42%、20.59%。與模型對照組相比，蛹蟲草肽聚乳酸微囊低、中、高劑量組及陽性對照組的肝/體比分別降低了6.33%、12.52%、10.42%和11.29%，其中除低劑量組外其它均表現(xiàn)出顯著性差異。(P<0.05)；腎/體比分別降低了6.54%、13.06%、11.19%和12.36%，差異均顯著(P<0.05)。腎/體比的結(jié)果表明蛹蟲草肽聚乳酸微囊對腎臟具有一定的保護(hù)作用，可抑制腎臟腫大。糖尿病模型小鼠的脾/體比與正常對照組相比則明顯降低了14.37%(P<0.05)，蛹蟲草肽聚乳酸微囊低、中、高劑量組和陽性對照組與模型對照組相比分別上升了11.62%、6.34%、12.86%和10.62%，且除低劑量組外差異均顯著(P<0.05)。而心/體比各組間則無明顯差異。

2.5 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇和尿素氮的影響

如圖2-6所示，本試驗(yàn)利用STZ復(fù)制糖尿病小鼠后，與正常對照組相比血清甘油三酯(TG)、血清膽固醇(CHO)、血清尿素氮(BUN)水平都顯著升高(P<0.01)，分別上升了20.59%、21.16%和23.13%。糖尿病小鼠經(jīng)灌胃治療4周后，與模型對照組相比，蛹蟲草肽聚乳酸微囊低、中、高劑量組及陽性對照組的TG、CHO、BUN水平均出現(xiàn)了明顯的下降現(xiàn)象(P<0.05)，TG下降值依次為6.50%、13.01%、11.38%和12.20%；CHO水平分別降低了8.37%、14.59%、11.24%和13.64%；BUN水平分別降低了8.55%、14.66%、13.25%和13.75%。由以上結(jié)果分析可知，中劑量組效果最佳。而陽性對照組的治療效果雖好于低、高劑量組，但卻不及中劑量組。

圖2-6 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠血脂的影響

2.6 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對肝糖元的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝糖元水平變化情況如圖2-7。與正常對照組相比，模型組小鼠的肝糖元含量下降了29.23%，差異極顯著(P<0.01)。糖尿病小鼠經(jīng)灌胃治療4周后，治療組的肝糖元的含量得到了提升。與模型對照組相比，蛹蟲草肽聚乳酸微囊低、中、高劑量組及陽性對照組的肝組織中糖元含量依次升高了14.19%、31.06%、21.47%和25.01%，且差異顯著(P<0.05)。

2.7 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對胰島素分泌的影響

由于STZ能直接破壞胰島β細(xì)胞，從而減少胰島素的分泌。結(jié)果如圖2-8所示。DM小鼠胰島素含量小于正常小鼠水平，正常對照組血清胰島素含量為(21.07±2.50)mU/L，而模型組僅為(13.04±1.61)mU/L，下降了38.11%，二者差異顯著(P<0.01)。經(jīng)MCP灌胃治療后，血清胰島素含量升高，中、高M(jìn)CP劑量組胰島素含量分別為(19.28±2.27)mU/L和(17.90±2.46)mU/L，顯著高于模型對照組(P<0.05)，從而說明MCP能有效促進(jìn)胰島素的分泌，這對血糖的降低有重要貢獻(xiàn)。在MCP劑量組中200 mg/(kg·bw)劑量組的胰島素水平最高，且高于陽性對照組。

圖2-8 蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病小鼠血清胰島素的影響

3 結(jié) 論

采用鏈脲佐菌素腹腔注射，小鼠出現(xiàn)了多飲、多食、消瘦癥狀，血糖明顯升高，這說明成功地建立了糖尿病小鼠模型。

蛹蟲草肽聚乳酸微囊能改善糖尿病小鼠消瘦和毛色暗淡等癥狀，降低糖尿病小鼠血糖濃度，加糖尿病小鼠肝臟中肝糖元的含量，增強(qiáng)糖尿病小鼠耐受葡萄糖能力，提高胰島素水平，說明蛹蟲草肽聚乳酸微囊具有降血糖功效。

蛹蟲草肽聚乳酸微囊可治療糖尿病并發(fā)癥。經(jīng)蛹蟲草肽聚乳酸微囊灌胃后的小鼠血脂水平(TG、CHO)得到了降低，說明蛹蟲草肽聚乳酸微囊可治療糖尿病引起的脂代謝紊亂癥。臟器/體重比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛹蟲草肽聚乳酸微囊可抑制肝、腎腫大，并修復(fù)脾臟的損傷。與模型對照組相比，蛹蟲草肽聚乳酸微囊中劑量的尿素氮水平下降了14.66%，腎/體比降低了13.06%，提示蛹蟲草肽聚乳酸微囊對糖尿病腎病有著治療作用。