李欣欣，楊永輝，李京，任秉輝，王輝，朱雁冰

惡性腦膠質(zhì)瘤是臨床上常見的顱腦腫瘤，其占顱腦腫瘤的比例高達(dá)60%[1]，主要以浸潤性方式生長，與腦組織無明確分界，通過手術(shù)難以徹底切除；并且擴(kuò)散速度快，復(fù)發(fā)性高。目前，手術(shù)切除后聯(lián)合放療是惡性腦膠質(zhì)瘤極為重要的治療方法，但大部分腦膠質(zhì)瘤對放療不敏感，導(dǎo)致治療效果仍不理想[2]。因此，增強(qiáng)惡性腦膠質(zhì)瘤的放射敏感性成為了優(yōu)化治療，改善患者預(yù)后的一個重要途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在肺癌、晚期乳腺癌、晚期結(jié)直腸癌中均異常表達(dá)[4-5]。另外有研究顯示，PTEN失活及survivin高表達(dá)是胃癌發(fā)展及預(yù)后的關(guān)鍵因素[6]；中華龍膽總黃酮通過PI3K/AKT/PTEN信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[7]。然而，PTEN對惡性腦膠質(zhì)瘤放射敏感性的影響目前尚不清楚。為此，本研究采用細(xì)胞實驗方法探討PTEN對惡性腦膠質(zhì)瘤放射敏感性的影響及其機(jī)制，以進(jìn)一步闡明PTEN在惡性腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料 惡性腦膠質(zhì)瘤組織(20例)以及距病變部位≥2 cm的癌旁正常組織標(biāo)本(10例)來自開灤總醫(yī)院；采集的標(biāo)本經(jīng)過患者和家屬同意，保存在液氮中備用。惡性腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞，正常腦膠質(zhì)HEB細(xì)胞(上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；DMEM(Dulbecco’s-modified Eagle’s medium)培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和LipofectamineTM2000(大連Takara公司)；PI3K抑制劑LY294002、AKT抑制劑CCT128930(美國Selleck生物科技公司)；PI3-kinase p110γ抗體，GAPDH多克隆抗體(上海圣克魯斯生物公司)；Anti-pan-AKT，Anti-GSK3β抗體(英國abcam公司)；siRNA NC，PTEN siRNA，pcDNA-PTEN質(zhì)粒(北京擎科生物有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)U251細(xì)胞、T98G細(xì)胞和HEB細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度約為90%時，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于12孔板中，細(xì)胞匯合至75%～80%時，將培養(yǎng)基更換成無血清培養(yǎng)基；用無FBS培養(yǎng)基稀釋各組重組質(zhì)粒和LipofectamineTM2000，將稀釋后的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體混勻，室溫孵育20 min；將混合物滴加到細(xì)胞中，或轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，采用0、2、4、6 Gy的X線垂直照射細(xì)胞，所用劑量率為3 Gy/min；48 h后收集各組細(xì)胞RNA和蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能實驗。

1.2.3 細(xì)胞增殖測定 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中；細(xì)胞匯合達(dá)70%～80%時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)染后用6 Gy X線照射細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清，每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽(tetramethylazozolium salt，MTT)溶液；孵育4 h后去上清，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取490 nm處每孔細(xì)胞的吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實驗 將-20 ℃保存的matrigel置于4 ℃融化，用無FBS DMEM培養(yǎng)基稀釋matrigel濃度為1 mg/mL。每個上室中加入100 μL稀釋后的matrigel，室溫孵育干成膠狀。細(xì)胞匯合達(dá)95%時，用6 Gy X線照射細(xì)胞，0.25%的胰酶消化后，用無FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋為細(xì)胞懸液，加入Transwell小室中；下室中加入完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下選取5個視野細(xì)胞觀察并計數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測 用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將各組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至T98G細(xì)胞，用6 Gy X線照射細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行中和，1 000 r/min離心15 min，棄上清。將沉淀置于70%的乙醇中，4 ℃固定過夜，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡水平。

1.2.6 PTEN mRNA表達(dá)量檢測 采用實時熒光定量PCR方法。將惡性腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織從液氮中取出，加入液氮進(jìn)行研磨，破碎后按RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組織中總RNA。取各對數(shù)生長期的惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，使用Trizol提取細(xì)胞RNA。用Nanodrop檢測總RNA的濃度和純度，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR；反應(yīng)程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；用2-△△Ct法分析實驗結(jié)果。實驗所用的引物為：GAPDH-F：CAAGGACCTCTACGCCAACAC；GAPDH-R：TGGAGGCGCGATGATCTT；PTEN-F：CACAGA-ATTCCAGACATGACAGCCATCATC；PTEN-R：GTG-GATCCTCATGGTGTTTTATCCCTCTTG。

1.2.7 PTEN蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。從液氮中取出腫瘤組織和癌旁組織剪碎，加入RIPA裂解液后研磨成組織勻漿，從組織蛋白中提取總蛋白。T98G細(xì)胞根據(jù)提取蛋白說明書提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，取適量樣品進(jìn)行點樣，以5%的濃縮膠、12%的分離膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉配制封閉液，將膜置于封閉液中在搖床上室溫封閉120 min。加入一抗在4 ℃下過夜反應(yīng)，TBST清洗5次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，采用ECL法進(jìn)行蛋白顯影。

2 結(jié) 果

2.1 惡性腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞的PTEN表達(dá)量 惡性腦膠質(zhì)瘤組織的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于瘤旁正常組織(均P<0.01)(圖1A-C)。腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于正常腦膠質(zhì)HEB細(xì)胞(P<0.05～0.01)，且在惡性腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞中的表達(dá)量最低(P<0.01)(圖1D-F)。因此選擇惡性腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

A：惡性腦膠質(zhì)瘤與癌旁正常組織的PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：惡性腦膠質(zhì)瘤與癌旁正常組織的PTEN蛋白表達(dá)水平檢測；C：惡性腦膠質(zhì)瘤與癌旁正常組織的PTEN蛋白表達(dá)水平比較；D：HEB、U251和T98G細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量比較；E：HEB、U251和T98G細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)水平檢測；F：HEB、U251和T98G細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.2 不同劑量X線照射T98G細(xì)胞的PTEN表達(dá)量比較 2 Gy、4 Gy、6 Gy X線照射T98G細(xì)胞的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于無X線照射(0 Gy)T98G細(xì)胞(P<0.05～0.001)；并且隨X線照射劑量增高，T98G細(xì)胞的PTEN表達(dá)量亦升高。見圖2。

A：不同劑量X線照射T98G細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：不同劑量X線照射T98G細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平檢測；C：不同劑量X線照射T98G細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.3 過表達(dá)PTEN對T98G細(xì)胞放射敏感性的影響 與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-PTEN組和pcDNA-3.1(+)+6 Gy組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.001，P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+6 Gy組相比，pcDNA-PTEN+6 Gy組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.001)(圖3A)。與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-PTEN組和pcDNA-3.1(+)+6 Gy組T98G細(xì)胞活力明顯下降、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05～0.01)；與pcDNA-3.1(+)+6 Gy組相比，pcDNA-PTEN+6 Gy組T98G細(xì)胞活力下降、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05～0.01)(圖3B-F)。

A：各組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：各組細(xì)胞的生長活性比較；C：各組細(xì)胞侵襲實驗的結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×200)；D：各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較；E：流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡數(shù)；F：各組細(xì)胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.4 下調(diào)PTEN對T98G細(xì)胞放射敏感性的影響 PTEN siRNA組T98G細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量顯著低于siRNA NC組，siRNA+6 Gy組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯高于siRNA NC組和PTEN siRNA+6 Gy組(均P<0.01)(圖4A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組T98G細(xì)胞活力明顯升高、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加、細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05～0.01)，siRNA+6 Gy組T98G細(xì)胞活力明顯降低、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05～0.01)；與siRNA+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組T98G細(xì)胞活力升高、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加、細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05～0.01)(圖4B-F)。

A：各組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：各組細(xì)胞的生長活性比較；C：各組細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×200)；D：各組細(xì)胞的侵襲數(shù)比較；E：流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡數(shù)；F：各組細(xì)胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.5 敲低PTEN對T98G細(xì)胞PI3K-AKT-GSK3β信號通路的影響 PTEN siRNA組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯低于siRNA NC組(P<0.01)(圖5A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細(xì)胞PI3K、AKT和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高(P<0.05～0.01)(圖5B-C)。用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后，阻斷了敲低PTEN誘導(dǎo)的AKT磷酸化；用AKT抑制劑CCT128930預(yù)處理細(xì)胞后，阻斷了敲低PTEN誘導(dǎo)的GSK3β磷酸化(圖5D-G)；表明AKT作用于PI3K的下游，而GSK3β作用于AKT的下游。

A：PTEN siRNA組與siRNA NC組細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：兩組細(xì)胞的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)量；C：兩組細(xì)胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β表達(dá)水平比較；D：LY294002處理組及PTEN siRNA組、siRNA NC組細(xì)胞的AKT、p-AKT蛋白表達(dá)量；E：3組細(xì)胞的p-AKT/AKT表達(dá)水平比較；F：CCT128930處理組及PTEN siRNA組、siRNA NC組細(xì)胞的GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)量；G：3組細(xì)胞的p-GSK3β/GSK3β表達(dá)水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.6 敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路對T98G細(xì)胞放射敏感性的影響 與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯下降，siRNA NC+6 Gy組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯升高(均P<0.01)；與siRNA NC+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.01)(圖6A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細(xì)胞活力明顯上升、細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增多、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)，siRNA NC+6 Gy組細(xì)胞活力下降、細(xì)胞侵襲數(shù)減少、細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05～0.01)；與siRNA NC+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組細(xì)胞活力上升、細(xì)胞侵襲數(shù)增多、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)；與PTEN siRNA+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy+LY294002組細(xì)胞活力降低、細(xì)胞侵襲數(shù)減少、細(xì)胞凋亡率增高(均P<0.05)(圖6B-F)。結(jié)果表明敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響T98G細(xì)胞的放射敏感性。

A：各組細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)量比較；B：各組細(xì)胞的生長活性比較；C：各組細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×200)；D：各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較；E：流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡數(shù)；F：各組細(xì)胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

3 討 論

近年來惡性腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率不斷上升，患者的預(yù)后不良，嚴(yán)重影響著生命健康。因此深入探討惡性腦膠質(zhì)瘤的致病機(jī)制具有重要意義。PTEN是具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，并通過其雙特異性磷酸酶活性調(diào)控多種信號途徑，進(jìn)而調(diào)控各種細(xì)胞的生命進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在腫瘤的形成中起重要作用，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，另外在腫瘤組織中常出現(xiàn)缺失或突變。如有研究顯示，在食管癌患者中PTEN表達(dá)下調(diào)[8]，在原位癌和外陰鱗狀細(xì)胞癌中PTEN發(fā)生了突變[9]，在腎癌、乳腺癌、腦癌和胰腺導(dǎo)管腺癌等癌癥中出現(xiàn)缺失或突變[10-12]。本研究分析了惡性腦膠質(zhì)瘤的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平，實驗結(jié)果顯示，惡性腦膠質(zhì)瘤組織和T98G細(xì)胞的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明PTEN的異常表達(dá)與惡性腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生具有相關(guān)性。

由于晚期惡性腦膠質(zhì)瘤患者對放射治療不敏感，對患者預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重影響；因此，提高惡性腦膠質(zhì)瘤對放射治療的敏感性至關(guān)重要。研究表明，細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等過程與放射敏感性密切相關(guān)；基因多態(tài)性及基因變異等都與放射敏感性相關(guān)[13-14]。PTEN負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期和多種信號途徑，能夠抑制細(xì)胞的遷移、分化、衰老及凋亡等多種生理活動。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因PTEN誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡與其脂質(zhì)磷酸酶抑制AKT的磷酸化有關(guān)[15]；在結(jié)直腸癌中，TRIM14通過抑制PTEN促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)，敲除PTEN在乳腺、皮膚及前列腺等多組織器官中的表達(dá)會引起腫瘤形成[17]。此外，miR-548-3p通過核因子活化B細(xì)胞的Κ輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factor-Κ-gene binding，NF-kB)靶向PTEN增加非小細(xì)胞肺癌的侵襲性[18]。本研究結(jié)果顯示，惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)X線照射后，PTEN mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，呈現(xiàn)出照射劑量依賴性。因PTEN是腫瘤抑制基因，在癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量較低；而惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)X線照射后細(xì)胞活力明顯降低，腫瘤細(xì)胞受到刺激后可能促使PTEN表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步發(fā)揮腫瘤抑制作用。過表達(dá)PTEN的T98G細(xì)胞經(jīng)X線照射后，其活力明顯下降、細(xì)胞侵襲數(shù)減少及細(xì)胞凋亡率增高；而用siRNA技術(shù)下調(diào)PTEN表達(dá)的T98G細(xì)胞行X線照射后，細(xì)胞活力明顯上升、細(xì)胞侵襲數(shù)增多及細(xì)胞凋亡率減低。結(jié)果表明，過表達(dá)PTEN能夠增強(qiáng)T98G細(xì)胞的放射敏感性，而下調(diào)PTEN能夠降低細(xì)胞的放射敏感性。

Alzahrani研究證實，PTEN失活能夠激活PI3K-AKT信號通路；而活化的PI3K-AKT信號通路參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、調(diào)控內(nèi)皮生長和血管生成等生物學(xué)進(jìn)程[19]。如Yoon等研究發(fā)現(xiàn)，紅皮蓮干果中的甲基lucidone通過抑制PI3K/AKT通路，引起卵巢癌細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡[20]。還有研究報道，非瑟酮通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞的抗癌作用[21]。本研究顯示，敲低惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的PTEN表達(dá)并行X線照射后，激活了細(xì)胞的PI3K-AKT-GSK3β信號通路，而且該信號通路介導(dǎo)了敲低PTEN對惡性腦膠質(zhì)瘤放射敏感性的影響。結(jié)果表明，沉默PTEN能夠通過激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性。有研究報道，腫瘤組織和細(xì)胞內(nèi)含有高水平的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，有利于維持腫瘤細(xì)胞的惡性表型；而敲低PTEN表達(dá)后，降低了ROS對AKT通路的阻斷，而使PKB/AKT通路保持一個高活化狀態(tài)，抵抗ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步使腫瘤細(xì)胞的放射敏感性降低[22]。本研究的結(jié)果與其一致，表明在惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，PTEN也是通過PI3K-AKT-GSK3β通路影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性；推測其作用機(jī)制也可能與細(xì)胞的ROS水平有關(guān)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，PTEN在惡性腦膠質(zhì)瘤中起抑癌作用，沉默PTEN能夠通過激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性。本研究結(jié)果表明，PTEN/PI3K-AKT-GSK3β軸可能成為增強(qiáng)惡性腦膠質(zhì)瘤患者放射敏感性的重要靶點。