朱瀟鵬，陳澤波，范宏軍，李甘，黃永凱，韓德清

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，約占神經(jīng)上皮腫瘤的60%，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]。其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的惡性程度最高，即使手術(shù)全切除聯(lián)合放療、化療等綜合治療，患者的中位生存期僅有12～14個月[2]。高級別腦膠質(zhì)瘤是指WHO Ⅲ-Ⅳ的膠質(zhì)瘤，腫瘤呈浸潤性生長，與瘤周組織分界不清，難以達(dá)到手術(shù)全切。殘余的腫瘤細(xì)胞加上其強(qiáng)增殖、強(qiáng)侵襲、新生血管豐富等特點(diǎn)，患者總體預(yù)后不佳[3]。當(dāng)前大量研究從分子遺傳水平探索腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，以期針對關(guān)鍵的腫瘤驅(qū)動因素進(jìn)行靶向治療，從而提高患者的治療效果。

microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、保守長度為20-24nt的非編碼小分子RNA，廣泛存在于哺乳動物中，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生理過程[4]。大量的研究證實miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度、患者的預(yù)后密切相關(guān)。課題組前期選用microRNA組織芯片對WHO Ⅱ-Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤組織和配對瘤周組織的1 924個microRNA分子的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)；分析的1 924個microRNA分子中13個表達(dá)異常，上調(diào)的microRNA分子12個，下調(diào)的1個；與瘤周組織相比，腦膠質(zhì)瘤中miR-93分子呈現(xiàn)異常的高表達(dá)[5]?？紤]到芯片檢測存在一定假陽性率，芯片結(jié)果需進(jìn)一步驗證。本研究，通過收集61例不同級別的膠質(zhì)瘤組織，運(yùn)用qRT-PCT技術(shù)，驗證miR-93在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。并進(jìn)一步設(shè)計實驗，探討miR-93在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本組患者中男37例，女24例；WHO Ⅰ-Ⅳ級的患者分別：5例、21例、15例和20例。病理診斷由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院病理科2名正/副主任醫(yī)師根據(jù)2016版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》診斷并進(jìn)行分型?；颊呋蚣覍僦橥狻Ｓ糜趯φ盏膩喼奕苏４竽X總RNA預(yù)混合物購自美國Clontech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及miRNA抑制物轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。構(gòu)建慢病毒干擾載體(紐恩生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)染時取對數(shù)期生長的U87和U251細(xì)胞，以2×105個/孔接種于6孔板，待80%細(xì)胞匯合后，按照說明書轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡下觀察是否轉(zhuǎn)染成功，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的miRNA的表達(dá)情況。將膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87和U251)分為3組：(1)空白對照組(miR-93)，U87、U251培養(yǎng)基中加入等量生理鹽水；(2)陰性對照組(NC)，U87、U251培養(yǎng)基中加入空白病毒載體；(3)轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組(miR-93 RNAi)，U87、U251培養(yǎng)基中加入miR-93病毒干擾載體。

1.3 膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中miR-93的表達(dá)檢測 將收集的膠質(zhì)瘤組織和U87、U251腫瘤細(xì)胞按照TRIzol試劑盒說明書(重慶川東化工公司)提取組織和細(xì)胞的總RNA。然后測定所提總RNA樣品在280 nm的光密度(D)值并定量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并使用SYBR green one 進(jìn)行定量PCR。PCR的擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。miR-93正向引物序列為 5′-AGGCCCAAAGTGCTGTTCGT-3′，反向引物序列為: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6作為miR-93的內(nèi)參基因，進(jìn)行3次獨(dú)立實驗。并使用△△CT方法分析基因的相對表達(dá)量，目標(biāo)量=2-△△CT。

1.4 細(xì)胞增殖實驗 取不同分組(空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組)U87和U251對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×103/孔接種到96孔中，設(shè)置4個復(fù)孔；用完全DMEM培養(yǎng)基于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，采用cell counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞的增殖情況。即每孔加入10 μL CCK-8試劑溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測450 nm波長處細(xì)胞的OD值。

1.5 細(xì)胞克隆形成實驗 檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251的細(xì)胞克隆形成。胰蛋白酶消化培養(yǎng)的U87、U251細(xì)胞，離心、計數(shù)，以2×103個細(xì)胞每孔重新接種于12孔板。繼續(xù)于37 ℃溫箱中培養(yǎng)2周，每3 d更換一次培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，加入4%多聚甲醛2 mL/孔，固定細(xì)胞15 min。去固定液后，加入1%的結(jié)晶染色劑1 mL/孔，染色20 min。洗滌染色液后，拍照保存，手動計數(shù)克隆。計算克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染干擾miR-93在U87和U251細(xì)胞中的表達(dá) U87和U251細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染后48 h后，熒光顯微鏡下細(xì)胞帶上綠色熒光(圖1)，提示慢病毒已轉(zhuǎn)染至細(xì)胞體內(nèi)并成功表達(dá)。qRT-PCR檢測miR-93在3組(空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組)細(xì)胞中的表達(dá)情況。設(shè)空白對照組miR-93的表達(dá)值為1，U87細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組表達(dá)水平0.022，低于空白對照組和陰性對照組，組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。U251細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組表達(dá)水平0.082；低于空白對照組和陰性對照組，組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。U87和U251的空白對照與陰性對照組的組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

A：空白對照組U87細(xì)胞；B：空白對照組U251細(xì)胞，在熒光顯微鏡下無熒光顯色；C：miR-93抑制物組U87細(xì)胞；D：miR-93抑制物組U251細(xì)胞，在熒光顯微鏡下見熒光顯色(熒光染色，×100)

2.2 miR-93在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平變化 與正常腦組織對比，61例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中，44例(72.1%)miR-93表達(dá)水平明顯高于正常腦組織。其中WHO Ⅰ級膠質(zhì)瘤的陽性表達(dá)率為20%(1/5)、Ⅱ級為71.4%(15/21)、Ⅲ級為73.3%(11/15)、Ⅳ級為85%(17/20)。WHO Ⅰ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中miR-93的表達(dá)量分別是1.25、5.91、6.71、31.20。WHO Ⅰ和WHO Ⅱ、WHO Ⅰ和WHO Ⅲ、WHO Ⅰ和WHO Ⅳ、WHO Ⅱ和WHO Ⅳ、WHO Ⅲ和WHO Ⅳ組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

N—正常對照組；**P<0.01 A：U251細(xì)胞；B：U87細(xì)胞；**P<0.01；U87、U251—空白對照組，U87-NC、U251-NC—陰性對照組，U87-inhibitor、U251-inhibitor—轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組

2.3 miR-93對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響 轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組U87和U251細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h的增殖活性比陰性對照及空白對照明顯降低(P<0.05)；陰性對照組與空白對照組U87、U251細(xì)胞光密度值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。結(jié)果表明抑制miR-93的表達(dá)后，膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞的體外增殖活性隨之降低。

2.4 miR-93 表達(dá)下調(diào)對U87、U251細(xì)胞克隆形成的影響 轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組的U87和U251細(xì)胞克隆形成數(shù)比陰性對照、空白對照明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；陰性對照組與空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。表明抑制miR-93的表達(dá)后，可以降低U87、U251的細(xì)胞克隆形成能力。

A：平板克隆形成實驗；B：各組細(xì)胞克隆數(shù)比較；**P<0.01；U87、U251—空白對照組，U87-NC、U251-NC—陰性對照組；U87-inhibitor、U251-inhibitor—轉(zhuǎn)染miR-93抑制物組

3 討 論

microRNAs作為內(nèi)源性、非編碼小RNA，通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)靶向結(jié)合，導(dǎo)致靶基因片段降解或失活，與siRNA類似，對靶基因的表達(dá)具有負(fù)性調(diào)控作用[6]。近年來的研究證實，miRNA與許多重要的生物過程相關(guān)，包括發(fā)育調(diào)節(jié)，器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡等。并參與了腫瘤致病過程中的眾多環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[4,7-8]。之前的研究表明，許多miRNA在膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，一些miRNA在腫瘤耐藥、疾病診斷及預(yù)后判斷中顯示出重要的指導(dǎo)作用[9-10]。因此，探明膠質(zhì)瘤中新的差異表達(dá)的miRNA分子，并明確其功能，將其作為治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)記，可為提高膠質(zhì)瘤患者的診治提供新思路。

前期研究利用miRNA芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-93分子在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，與瘤周組織相比，miR-93在腦膠質(zhì)瘤中過表達(dá)[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在許多其他的腫瘤中miR-93表達(dá)異常，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。如在非小細(xì)胞肺癌中，異常表達(dá)的miR-93通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[11]。在肝癌中，miR-93通過直接作用于PDCD4促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。但在腦膠質(zhì)瘤中miR-93的表達(dá)尚存在爭議，miR-93的功能及其機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

其他學(xué)者研究表明，miR-93在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中過表達(dá)，且miR-93的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度及患者總生存期密切相關(guān)[13-14]。Malekpour等研究報道，應(yīng)用實時定量PCR檢測178 例腦膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織的miR-93表達(dá)水平，與瘤周組織對比，腦膠質(zhì)瘤組織中miR-93呈現(xiàn)明顯低表達(dá)，和之前的研究相反，并且miR-93的低表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及患者的預(yù)后相關(guān)[15]。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的miR-93表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-93在膠質(zhì)瘤組織中普遍高表達(dá)。且和腫瘤的WHO分級(腫瘤的惡性程度)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。隨著膠質(zhì)瘤的惡性程度增加，miR-93的表達(dá)隨之增加，可為臨床判斷腫瘤的惡性程度提供一定的參考。并且miR-93在一定程度長反映了膠質(zhì)瘤的惡性程度，可能與其促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建慢病毒載體，抑制miR-93的表達(dá)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的增殖活力被明顯抑制；表明miR-93與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。目前miR-93參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚不清楚。有研究顯示，miR-93的上調(diào)可通過激活PI3K/AKT 通路，影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程，包括PTEN、VEGF、IL-8、PHLPP2、FOXO3等PI3K/AKT 信號通路上關(guān)鍵的基因均已被證實受miR-93的直接調(diào)控[13,16-17]。此外miR-93還可通過自我調(diào)節(jié)環(huán)路發(fā)揮作用，如在腎癌細(xì)胞中，STAT3活化后入核結(jié)合到 miR-93 上游啟動區(qū)域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。而這過程是通過miR-93特異性結(jié)合 DAPK1-m RNA 3’UTR 區(qū)，抑制蛋白翻譯所發(fā)揮作用的；過表達(dá)DAPK1后，又可以反過來影響 STAT3活化，從而影響miR-93的表達(dá)[18]。

miR-93系miR-106b-25 cluster的3個成員之一[19]。microRNA組織芯片結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中miR-106b-25 cluster的成員(miR-106b、miR-93和miR-25)均高表達(dá)。miR-92a-3p、miR-18a-5p和miR-19b-3p(miR-17-92 cluster的成員)在WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)，miR-106b-5p、miR-93-5p(miR-106b-25 cluster 的成員)在WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常。miR-106b-25 cluster 和miR-17-92 cluster的成員中4個miRNA分子的種子區(qū)(seedregion)完全相同。從第2個到第8個核苷酸被稱為種子區(qū)，是miRNA上進(jìn)化最為保守的片段。相同種子區(qū)的miRNA可能識別并結(jié)合相同的3’UTR區(qū)域，所調(diào)控的靶基因可能相同。miR-93表達(dá)水平的增高程度可在一定程度上反映腦膠質(zhì)瘤的惡性程度。而miR-93在WHO Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，具有相同種子區(qū)的miRNA依次出現(xiàn)，表明與miR-93類似功能的miRNA分子數(shù)目增加，這也可能是miR-93過表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)的機(jī)制?；谝陨?，推測miR-106b-25 cluster 和miR-17-92 cluster的成員增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡，提高腫瘤的惡性程度，參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程[19-22]。

綜上所述，miR-93在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤的惡性程度不斷增加，miR-93的表達(dá)水平隨之增高；miR-93作為致癌基因，當(dāng)被抑制后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性下降。但miR-93影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的具體的信號通路及機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究探討。