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大鯢虹彩病毒病滅活疫苗安全性與免疫效力研究

2021-07-15 12:33索鈺杰李逸群范玉頂劉文枝薛明洋曾令兵
淡水漁業(yè) 2021年4期
關(guān)鍵詞:大鯢效價活疫苗

索鈺杰,林 格,江 南,李逸群,范玉頂 ,劉文枝,孟 彥,薛明洋,曾令兵,周 勇

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,武漢 430223;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,武漢 430070)

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱“娃娃魚”,隸屬有尾目(Caudata)隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)大鯢屬(Andrias),是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物,具有很高的科研與營養(yǎng)價值[1-2]。隨著大鯢養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟、規(guī)模的持續(xù)擴大、集約化程度的不斷提高,大鯢養(yǎng)殖過程中的病害問題日益突出[3-4]。其中,由大鯢虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)引起的大鯢病毒性疾病危害最為嚴重,死亡率最高達100%,給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[5]。

疫苗免疫被認為是預(yù)防大鯢虹彩病毒病發(fā)生的最有效途徑[6-9]。曾憲輝等[6]以GSIV的主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)為靶點構(gòu)建的DNA疫苗,在免疫后28 d仍可從大鯢的肌肉、肝、脾和腎組織中檢出MCP基因,該DNA疫苗的相對免疫保護率為73.3%。Zhou等[7]根據(jù)酵母密碼子偏好性優(yōu)化GSIV MCP基因序列后,利用酵母表達了MCP蛋白,將蛋白純化后免疫大鯢,其相對保護率可達78.0%。Liu等[8]使用1.0×106TCID50/mL的劑量滅活疫苗免疫大鯢,其相對免疫保護效力為72.0%,證明了滅活疫苗也有較好的免疫保護效果。孫建濱等[9]用β-丙內(nèi)酯滅活病毒制備了大鯢虹彩病毒滅活疫苗,明確了滅活的最適條件為0.1%的β-丙內(nèi)酯于4 ℃滅活細胞培養(yǎng)的GSIV 72 h。雖然已有多種疫苗被證實能有效的預(yù)防大鯢虹彩病毒病,但由于疫苗的安全性和免疫效力研究不完善,制約了上述疫苗的產(chǎn)業(yè)化與推廣,因此未能從根本上解決大鯢虹彩病毒病對大鯢養(yǎng)殖業(yè)的影響。

本研究以大鯢虹彩病毒滅活疫苗為對象,探究疫苗的不同免疫劑量、免疫時間、免疫次數(shù)對大鯢的安全性以及免疫后大鯢體內(nèi)相關(guān)免疫基因的表達特征、血清中和抗體滴度與免疫保護效果,以期為大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的產(chǎn)業(yè)化推廣提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗大鯢

大鯢來源于湖北龍興水產(chǎn)生物科技有限公司,9月齡,平均體重為(29.31±5.14)g,體長(15.62±5.20)cm。將大鯢飼養(yǎng)于規(guī)格為80 cm(長)×60 cm(寬)×15 cm(高)的塑料周轉(zhuǎn)箱中,養(yǎng)殖室內(nèi)溫度維持在20~22 ℃,養(yǎng)殖期間投喂新鮮魚肉,每天換水一次。實驗前隨機抽樣大鯢,采用PCR方法檢測GSIV,確認GSIV陰性后用于實驗。

1.2 病毒及細胞系

大鯢虹彩病毒(GSIV)由本實驗室分離鑒定;鯉上皮瘤細胞系(Epithelioma papulosum cyprin,EPC)來自于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號為CCTCC GDC0174。

1.3 實時熒光定量PCR引物及反應(yīng)程序

設(shè)計大鯢β-Actin、MyD88、TLR9和MHCIIA基因的熒光定量PCR引物(表1),由武漢天一輝遠生物技術(shù)有限公司合成。采用Trizol Reagent提取大鯢組織RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以其為模板進行實時熒光定量PCR擴增,每個樣品設(shè)3個平行。實時熒光定量PCR擴增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性25 s;55 ℃退火25 sec;72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。

表1 實時熒光定量PCR法擴增引物

1.4 大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的制備

于T75細養(yǎng)瓶中(Corning,USA)培養(yǎng)EPC細胞。待細胞生長至匯合單層,以GSIV感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為0.5的感染劑量接種EPC細胞,25 ℃培養(yǎng)并逐日觀察細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),待細胞病變大于80%時收獲病毒。于96孔板中測定病毒的TCID50,將收獲的病毒液分為兩份,一份用于攻毒實驗和血清中和抗體效價的測定。另一份病毒液用緩沖液(PBS)稀釋至1.0×106TCID50/mL后,加入體積分數(shù)為0.1%的β-丙內(nèi)酯,4 ℃滅活72 h,即成大鯢虹彩病毒病滅活疫苗,置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 疫苗安全性實驗

取健康大鯢180尾,平均分為6組,分別為:一次單劑量免疫組、超劑量免疫組、單劑量重復(fù)免疫組和3組對照,各組大鯢在相同條件下隔離飼養(yǎng)。暫養(yǎng)一周后,實驗組和對照組通過腹腔注射途徑,分別注射疫苗和PBS。一次單劑量免疫組注射0.2 mL滅活疫苗,超劑量免疫組注射1 mL滅活疫苗,單劑量重復(fù)免疫組連續(xù)注射3次0.2 mL滅活疫苗(每天注射1次),分別設(shè)置對照組(注射PBS)。每日觀察實驗大鯢的攝食和活動情況,14 d后剖檢觀測臟器。

1.6 最小免疫劑量的測定

取健康大鯢360尾,隨機分為6組,分別為5個免疫組和1個對照組。將實驗疫苗隨機取樣,采用腹腔注射接種途徑,分別按照0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/尾的免疫劑量對大鯢進行免疫;對照組每尾注射0.5 mL的PBS,作為非免疫對照。免疫后第2 、4 、7 、14 、21 和28 天,從不同劑量免疫組與對照組中各取3尾大鯢,尾靜脈取血,用于血清抗體效價的測定;采集脾臟,提取脾臟總RNA,檢測樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達量的變化。將待檢測的血清在56 ℃水浴30 min,用M199培養(yǎng)基將血清稀釋10倍后,按2倍等比稀釋,即血清從1∶10稀釋至1∶1 280,取50 μL不同稀釋度的血清與50 μL 100 TCID50/0.1 mL的GSIV病毒液在96孔板中混合,每個血清稀釋濃度設(shè)六個復(fù)孔,并設(shè)陽性與陰性對照孔?;靹蚝笾糜?5 ℃培養(yǎng)箱中孵育,每隔20 min混勻一次,2 h后每孔加入100 μL的細胞懸液,置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后觀察結(jié)果,以Reed-Muench 法計算血清的中和抗體滴度。免疫28 d后,實驗組與對照組大鯢腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL),每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況,連續(xù)觀察14 d。實驗結(jié)束后,測定疫苗的相對保護率(relative percent survival,RPS)。

RPS =( 1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%

1.7 疫苗免疫期的測定

取健康大鯢130尾,隨機分為2組,1個免疫組和1個對照組。將實驗疫苗隨機取樣,采用腹腔注射接種途徑,免疫組65尾,每尾注射0.2 mL滅活疫苗;對照組65尾,每尾注射0.2 mL的PBS。免疫后第35、42、49、56、90、120和150天,從免疫組與對照組中各取3尾,尾靜脈取血,用于血清抗體效價的測定;采集脾臟,提取脾臟總RNA,檢測樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達量的變化。免疫150 d后,實驗組與對照組大鯢腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL),每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況,連續(xù)觀察14 d。實驗結(jié)束后,測定疫苗的相對保護率。

1.8 第二次免疫最小間隔期的測定

取健康大鯢600尾,分別隨機分為10組,分別為5個免疫組和5個對照組。將試驗疫苗隨機取樣,采用腹腔注射接種途徑,免疫組300尾,每尾注射2次0.2 mL滅活疫苗(1.0×106TCID50/mL);對照組300尾,每尾在一次免疫時注射0.2 mL的滅活疫苗(1.0×106TCID50/mL),但二次免疫時注射0.2 mL PBS。免疫組和對照組同時進行一次免疫,在第一次免疫后的第7、14、21、28和56 d分別對免疫組和對照組進行第二次免疫,并在二次免疫后的第7、14、21、28、56、90、120和150 d,隨機從免疫組與對照組中各取3尾,尾靜脈取血,用于血清抗體效價的測定;采集脾臟,提取脾臟總RNA,檢測樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達量的變化。在第二次免疫150 d后試驗組連同對照組的每尾大鯢各腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL),每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況,連續(xù)觀察14 d。實驗結(jié)束后,計算二次免疫后大鯢的存活率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS21.0數(shù)據(jù)分析軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,用單因素方差分析進行組間差異性分析,以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗安全性實驗

大鯢經(jīng)腹腔注射單劑量、超劑量和單劑量重復(fù)的大鯢虹彩病毒病滅活疫苗,通過14 d觀察,免疫動物攝食和活動行為均正常,未出現(xiàn)臨床癥狀以及局部反應(yīng)。接種14 d后,對實驗大鯢剖檢發(fā)現(xiàn),注射部位、肌肉及內(nèi)臟器官未見異常。實驗結(jié)果表明,大鯢虹彩病毒病滅活疫苗對大鯢的安全性較好。

2.2 最小免疫劑量實驗結(jié)果

2.2.1 血清中和抗體效價結(jié)果

以不同劑量的疫苗免疫大鯢后,免疫組和對照組大鯢的血清抗體效價的變化如圖1所示。在整個實驗期間,對照組的血清抗體效價一直維持在1 ∶2左右,而免疫組的血清抗體效價隨免疫劑量的增加而增加。0.1 mL劑量組血清抗體效價明顯低于其它實驗組,0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL劑量組的血清抗體效價相近,且差異較小。不同劑量免疫組的血清抗體效價都在免疫后第21 d達到最高值,0.1 mL時大鯢的血清抗體效價121.10±26.62,極顯著高于對照組,而其他免疫劑量組的血清抗體效價,在252.48±28.01和265.03±29.23之間,極顯著高于對照組。

圖1 不同劑量疫苗免疫大鯢后的血清抗體效價

2.2.2 免疫相關(guān)基因的表達變化

免疫大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后,MyD88、TLR9和MHCIIA基因在脾臟中的表達量均有上升,3種免疫基因的表達變化如圖2所示。免疫劑量越高,各免疫相關(guān)基因表達量上升的幅度越大,且不同劑量的同一免疫相關(guān)基因表達含量的變化趨勢相同,0.1 mL實驗組免疫基因上調(diào)幅度最小,而其它4組實驗組免疫基因上調(diào)幅度相近。免疫后第7 dMyD88基因達到峰值,0.1 mL免疫組升高1.99倍,0.2~0.5 mL免疫組升高范圍為2.78~3.08倍;免疫后第4 dTLR9基因達到峰值,0.1 mL免疫組升高2.11倍,0.2~0.5 mL免疫組升高范圍為2.78~3.30倍;免疫后第4 dMHCIIA基因達到峰值,0.1 mL免疫組升高1.93倍,0.2~0.5 mL免疫組升高范圍為2.58~2.85倍,與對照組相比,均有顯著性差異。

圖2 不同劑量疫苗免疫大鯢后的相關(guān)免疫基因表達量的變化

2.2.3 相對免疫保護率

免疫不同劑量大鯢虹彩病毒病滅活疫苗28 d后,對實驗組大鯢和對照組大鯢進行攻毒實驗,檢測其相對免疫保護率。0.1 mL免疫組,疫苗的相對免疫保護率為44.44%;0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL免疫組疫苗的相對免疫保護率相同,均為72.22%;0.5 mL免疫組,疫苗的相對免疫保護率為77.78%(圖3)。

圖3 大鯢最小免疫劑量實驗相對免疫保護率

2.3 免疫持續(xù)期實驗結(jié)果

2.3.1 血清中和抗體效價結(jié)果

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后,檢測大鯢的血清抗體效價在150 d內(nèi)的變化情況,實驗結(jié)果如圖4所示。對照組的血清抗體效價一直維持在1∶2左右,實驗組的血清抗體效價呈現(xiàn)為先快速升高后保持相對穩(wěn)定的趨勢。免疫7 d后血清抗體效價開始顯著增高,21 d實驗組的血清抗體效價上升到最高水平252.48±28.01,極顯著高于對照組。血清抗體效價在28 d到120 d維持穩(wěn)定,從150 d開始下降,但仍顯著高于對照組大鯢的血清抗體效價。

圖4 大鯢虹彩病毒病疫苗免疫大鯢后血清抗體效價的變化

2.3.2 免疫相關(guān)基因的表達變化

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后,檢測150 d內(nèi)大鯢脾臟中MyD88、TLR9和MHCIIA基因的表達情況。MyD88基因在免疫第7 d時達到峰值,TLR9基因在第4 d達峰值,MHCIIA基因在第4 d達到峰值(圖5)。實驗組的免疫基因表達呈現(xiàn)先快速升高后下降的趨勢,下降后免疫基因表達量略高于對照組。

圖5 大鯢虹彩病毒病滅活疫苗免疫大鯢后相關(guān)免疫基因表達量的變化

2.3.3 相對免疫保護率

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗150 d后,對實驗組和對照組的大鯢進行攻毒實驗,實驗組相對免疫保護率為62.5%(圖6)。

圖6 攻毒后大鯢的死亡率和相對免疫保護率

2.4 第二次免疫最小間隔期實驗結(jié)果

2.4.1 第二次免疫血清中和抗體效價結(jié)果

在不同第二次免疫間隔期實驗組中,大鯢血清抗體效價的變化如表2所示。在一次免疫后第7 d或第14 d后進行第二次免疫,血清抗體效價都呈現(xiàn)出先增高后持平趨勢,分別在二次免疫后的第7 d和第14 d血清抗體效價開始增高,在二次免疫后的第90 d達到最高值,最高值分別為261.38±18.23和265.03±22.34;在一次免疫后第21 d、28 d和56 d后進行二次免疫,血清抗體效價整體持平,但高于一次免疫時的最高血清抗體效價,一次免疫后的21 d進行二次免疫,可以最快達到最高血清抗體效價,最高值為274.37±25.23,極顯著高于對照組。

表2 不同二次免疫間隔期免疫后大鯢的血清抗體效價

2.4.2 免疫相關(guān)基因的表達變化

第二次免疫后MyD88、TLR9和MHCIIA基因均呈現(xiàn)出先升高后降低并持平的趨勢(圖7)。不同間隔期二次免疫后,免疫基因均呈先增高后下降的趨勢。一次免疫后21 d進行二次免疫,MyD88、TLR9和MHCIIA基因的變化趨勢最明顯,二次免疫后第7 d免疫基因的增幅達到峰值,MyD88基因增高2.09倍,TLR9基因增高2.52倍,MHCIIA基因增高1.68倍,均顯著高于對照組。

圖7 一次免疫后不同時間二次免疫大鯢后的相關(guān)免疫基因表達量的變化

2.4.3 第二次免疫的存活率

在第二次免疫后150 d對大鯢進行攻毒實驗,檢測其存活率。一次免疫間隔7 d后和14 d后進行二次免疫的存活率都為66.67%。一次免疫間隔21 d后和28 d后進行二次免疫,其存活率分別為86.67%和80.00%。一次免疫間隔56 d后進行二次免疫的存活率為76.67%(表3)。

表3 大鯢第二次免疫最小間隔期實驗存活率

3 討論

疫苗免疫選擇合適的免疫年齡至關(guān)重要,因為免疫系統(tǒng)在年齡較小時尚未發(fā)育成熟,無法產(chǎn)生有效的保護力,所以接種滅活疫苗的年齡不宜太小[10]。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)大鯢部分與免疫相關(guān)的器官在6月齡至9月齡發(fā)育完全。歐燎原[12]發(fā)現(xiàn)9月齡時,幼鯢體型上與成鯢一致,基本發(fā)育完全,外鰓呼吸功能萎縮并逐步脫落,但因為機體免疫和自我防御能力的下降,幼鯢極易患病。為了大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的高效利用,本研究選擇9月齡的大鯢開展疫苗的安全性與免疫效力的研究。

安全性是疫苗最為重要的數(shù)據(jù),對疫苗開展安全性評價是任何一個新疫苗在研發(fā)階段或者推向市場之前都必須要進行的[13]。崔艷麗[14]在研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感(H9亞型)四聯(lián)滅活疫苗(LaSota株+M41株+HS25株+HZ株)后,從單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和一次性超劑量接種三個方面證明了疫苗的安全性,為疫苗的有效使用提供了安全保障。本研究對大鯢進行了一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和超劑量接種實驗,接種疫苗后發(fā)現(xiàn)實驗大鯢攝食和行為正常,均未出現(xiàn)臨床癥狀以及局部反應(yīng),剖檢實驗大鯢后觀察發(fā)現(xiàn),注射部位、肌肉及臟器未見異常,證明該疫苗安全。

過小的免疫劑量不能有效刺激機體產(chǎn)生充足的免疫力[15]。疫苗的免疫效果好、副反應(yīng)小和生產(chǎn)成本少是疫苗生產(chǎn)應(yīng)用與推廣的關(guān)鍵參數(shù)。王曉麗等[16]將兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗以0.25、0.5和1 mL/只三種不同劑量組免疫健康易感兔,其測得最小免疫劑量為0.5 mL/只;劉澤文等[17]以1.2、1.6、2.0和2.4 mL的仔豬紅黃痢疫苗免疫懷孕母豬,確定疫苗的最小免疫劑量為1.6 mL。本研究采用0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL/尾的大鯢虹彩病毒病滅活疫苗,對健康大鯢免疫,28 d后對其進行攻毒,實驗結(jié)果表明,不同免疫劑量均能觸發(fā)大鯢產(chǎn)生保護率,免疫劑量越高,血清抗體效價越高,免疫基因表達量上調(diào)幅度越大,相對免疫保護率也越高。當(dāng)免疫劑量為0.2 mL及以上時對大鯢虹彩病毒的攻毒保護率均不低于70%,因此確定該疫苗的最小免疫劑量為0.2 mL/尾,為生產(chǎn)中免疫程序的合理制定提供參考依據(jù)。

疫苗免疫動物后刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),從應(yīng)答產(chǎn)生到免疫力產(chǎn)生需要一定的時間[18]。通過實驗確定疫苗免疫產(chǎn)生時間和免疫持續(xù)時間可以幫助了解疫苗免疫后何時能產(chǎn)生有效保護,從而在免疫效力未達到或低于保護水平時可采取加強飼養(yǎng)管理、調(diào)整免疫程序提前免疫或加強免疫等措施來減少免疫空白期及低下期的產(chǎn)生[19]。李杰等[20]研究了鰻弧菌(Vibrioanguillarum)O1/O2血清型二價滅活疫苗免疫大菱鲆后的免疫保護期,發(fā)現(xiàn)大菱鲆獲得的免疫保護持續(xù)期大于150 d。本研究在免疫后150 d測定其攻毒保護水平,測得大鯢的相對免疫保護率分別為62.5%。研究結(jié)果表明MyD88基因在免疫第7 d時達到峰值,TLR9基因、MHCIIA基因在第4 d時達到峰值,免疫21 d以后血清抗體效價達到最高值252.48±28.01,表明大鯢免疫21 d后可以建立預(yù)期的免疫保護。

二次免疫能夠提高宿主的抗體水平、延長抗體持續(xù)時間,從而延長疫苗的免疫保護期[21-22]。丁山等[21]研究鰻弧菌三價滅活疫苗對大菱鲆的保護效果,發(fā)現(xiàn)二次免疫后,大菱鲆的相對免疫保護率高于70%,一次免疫的有效免疫保護期不低于120 d,二次免疫的有效免疫保護期不低于150 d??祷埚蔚萚22]研究堆型艾美耳球蟲疫苗蟲株發(fā)現(xiàn)二次免疫可使抗體水平迅速提高,在最適時間進行二次免疫,對雛雞有促生長作用,并可增強免疫力,實驗結(jié)果表明二次免疫間隔為7 d時可達到良好的免疫效果;本研究分別于一次免疫后的第7、14、21、28和56 d進行二次免疫,研究結(jié)果表明,一次免疫后21 d進行二次免疫血清抗體效價可以最快達到最高水平274.37±25.23,相關(guān)免疫基因的表達也能較快達到最高水平并且維持較長時間。一次免疫后14、21、28和56 d進行二次免疫,大鯢的存活率均高于一次免疫后的存活率。因此,確定大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的二次免疫最小間隔期為21 d。大鯢虹彩病毒病滅活疫苗二次免疫時間的確定,有效提高了疫苗的免疫效力和延長了疫苗的保護時間。

綜上所述,本文圍繞大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的安全性與免疫效力開展了系統(tǒng)的研究,明確了疫苗的安全性,確定了大鯢虹彩病毒病疫苗的最小免疫劑量為0.2 mL/尾、二次免疫最小間隔期為21 d,為大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

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