田立立，萬金娟，孟祥龍，周梓涵 ，孫龍生，唐建清

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京210017)

pH既是水體水質(zhì)、水域環(huán)境的重要監(jiān)測指標，也是影響?zhàn)B殖生物生存狀況的重要生態(tài)因子。研究表明，甲殼類動物均有其pH耐受和適宜范圍，當水體pH偏離其適宜范圍時，勢必會導(dǎo)致其存活、攝食、生長代謝、離子平衡和外骨骼的礦化作用等受到一定程度的影響[1，2]。在蝦蟹養(yǎng)殖過程中，為凈化水質(zhì)或為蛻殼時提供隱蔽躲藏場所種植的大量水草，由于合作用導(dǎo)致水中CO2大量消耗，易引起水體pH值的升高[3，4]。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，又稱小龍蝦，不僅肉質(zhì)細嫩，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，而且又可作為工業(yè)及醫(yī)學(xué)原料，已成為最受歡迎的水產(chǎn)品之一[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于高pH對克氏原螯蝦的脅迫研究主要集中在急性脅迫方面，如陶易凡等[6]報道了急性高pH脅迫會加劇克氏原螯蝦肝胰腺和鰓組織結(jié)構(gòu)損傷；Ali等[7]研究認為高pH脅迫24 h內(nèi)克氏原螯蝦碳酸酐酶(CA)、Na+/K+- ATP酶(NKA)和V型H+- ATP酶(HAT)顯著表達，而關(guān)于高pH慢性脅迫對克氏原螯蝦的影響鮮有報道。本試驗以養(yǎng)殖水體pH為變化因子，探討高pH急性和慢性脅迫對克氏原螯蝦非特異性免疫及抗氧化能力的影響，為克氏原螯蝦生態(tài)健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用蝦

試驗蝦取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中基地。選擇規(guī)格基本一致、活力好、附肢健全、均體重為(21.11±0.83)g的養(yǎng)成蝦用于試驗。應(yīng)激試驗前將試驗蝦暫養(yǎng)在室外水泥池(2 m×2 m×0.8 m，水深30 cm)15 d，每天早晚(8：00和18：00)各投喂商品料一次，投喂量為蝦體重的2%～4%。水泥池采用微流水系統(tǒng)，試驗用水為四級過濾后的長江水。

1.2 試驗方法

試驗蝦暫養(yǎng)15 d后禁食24 h，隨后轉(zhuǎn)入室內(nèi)養(yǎng)殖箱(70 cm×40 cm×30 cm，水深10 cm)中進行高pH應(yīng)激試驗。設(shè)置對照(pH 7.6)和試驗(pH 10.2)2個pH處理組，對克氏原螯蝦進行急性(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、5 d)和慢性(10、15 d)pH脅迫試驗。試驗組用NaOH調(diào)節(jié)水體pH，使試驗水體pH始終保持在10.2左右 ，連續(xù)處理15 d，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾蝦。試驗用水為曝氣2 d以上的自來水，水溫23.5～24.5 ℃；試驗期間正常投喂，并在投喂2 h后清除殘餌及糞便，同時觀察蝦的活力，并及時撈出死蝦。盡量減少人為干擾，防止額外應(yīng)激。

1.3 樣品采集與處理

參照文獻[6]的方法，分別在pH應(yīng)激前(0 h)和應(yīng)激后3 h、6 h、12 h、24 h、5 d、10 d和15 d從每箱隨機選取2尾蝦(每組6尾蝦)，分別采集血漿、鰓和肝胰腺組織。用 1 mL 預(yù)先加入預(yù)冷抗凝劑的無菌注射器從螯蝦頭胸甲背側(cè)取血淋巴，注入到1.5 mL無菌離心管中，使血液與抗凝劑最終比例為1∶1，離心( 4 ℃，3 000 r/min) 10 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用無菌鑷子取螯蝦的鰓絲、肝胰腺放入1.5 mL 離心管中，液氮速凍，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標與方法

肝胰腺、鰓樣品解凍后，加入9倍體積的生理鹽水冰浴勻漿制成10%勻漿液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

血漿指標：總蛋白(TP)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、葡萄糖(GLU)、皮質(zhì)醇(CORTISOL)；肝胰腺指標：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽過氧化物(GSH-Px)、丙二醛(MDA)；鰓指標：乳酸脫氫酶(LDH)、Na+-K+-ATP酶(NKA)。測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照使用說明進行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL記錄數(shù)據(jù)，以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用SPSS 20.0對試驗結(jié)果進行單因素方差分析(One-Way ANOVA) 及Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。大、小寫字母不同分別表示組內(nèi)不同時間點、組間相同時間點差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高pH脅迫對克氏原螯蝦血漿免疫相關(guān)指標的影響

各時間點對照組血漿免疫指標無顯著變化(圖1)。高pH急性脅迫下，試驗組TP含量隨脅迫時間的延長呈上升趨勢，脅迫24 h時開始顯著提高，且顯著高于對照組。高pH慢性脅迫下，試驗組血漿TP含量進一步提高；試驗組與對照組間血漿LZM活性無顯著差異。高pH急性脅迫下，6 h與5 d時試驗組血漿AKP顯著高于對照組，并于24 h恢復(fù)至應(yīng)激前水平。高pH慢性脅迫下，AKP活性顯著升高，之后持續(xù)保持較高水平；高pH急性脅迫顯著提高試驗組ACP活性，高pH慢性脅迫下試驗組血漿ACP活性先上升后下降，且于脅迫10 d時酶活性達到峰值，脅迫后各時間點ACP活性均顯著高于對照組。

圖1 高pH脅迫對克氏原螯蝦血漿免疫指標的影響

2.2 高pH脅迫對克氏原螯蝦血漿血糖和皮質(zhì)醇含量的影響

由圖2可知，各時間點對照組血糖與皮質(zhì)醇含量無顯著變化。高pH急性脅迫下初期試驗組血糖變化不大，5 d時血糖含量顯著升高，且顯著高于對照組。高pH慢性脅迫時，血糖含量呈下降趨勢，并于10 d時恢復(fù)至應(yīng)激前的狀態(tài)水平；高pH急性脅迫時試驗組血漿皮質(zhì)醇含量持續(xù)升高，于5 d時達到峰值。高pH慢性脅迫下，試驗組血漿皮質(zhì)醇含量下降，10 d時恢復(fù)至正常水平。

圖2 高pH脅迫對克氏原螯蝦血糖和皮質(zhì)醇含量的影響

2.3 高pH脅迫對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

各時間點對照組克氏原螯蝦肝胰腺SOD、GSH-Px、MDA水平無明顯變化(見圖3) 。高pH急性脅迫下試驗組SOD活性呈下降趨勢，并于24 h開始顯著低于對照組，脅迫5 d時，試驗組SOD活性達到最低值。高pH慢性脅迫下，SOD活性顯著上升，恢復(fù)至應(yīng)激前水平；與應(yīng)激前相比，高pH急性脅迫(3～24 h)顯著降低試驗組GSH-Px活性。高pH慢性脅迫下GSH-Px活性先升高后降低，并于10 d達到峰值，且顯著高于對照組；高pH急性脅迫前期(24 h內(nèi))試驗組MDA含量無顯著變化，5 d時試驗組MDA含量顯著上升。高pH慢性脅迫下，試驗組MDA含量于脅迫10 d時達到峰值，且顯著高于對照組。脅迫5～15 d之間試驗組MDA含量沒有顯著差異。

圖3 高pH脅迫對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

2.4 高pH脅迫對克氏原螯蝦鰓組織代謝酶活性的影響

圖4結(jié)果顯示，各時間點對照組鰓LDH、NKA活力沒有顯著差異。在高pH急性脅迫初期(12 h內(nèi))，試驗組LDH活力呈下降趨勢，且顯著低于對照組。24 h后試驗組LDH活力恢復(fù)至應(yīng)激前水平，與對照組相比無顯著差異。高pH慢性脅迫下，LDH活力呈下降趨勢，但均與對照組沒有顯著差異；高pH脅迫對試驗組鰓NKA活力沒有顯著影響。隨著脅迫時間的延長，試驗組NKA活力呈波浪式變化，但均與對照組沒有顯著差異。

圖4 高pH脅迫對克氏原螯蝦鰓乳酸脫氫酶、Na+-K+-ATPase活力的影響

3 討論

3.1 高pH脅迫對克氏原螯蝦血漿免疫指標的影響

溫度、環(huán)境氨氮水平和蛻皮周期等均會影響甲殼類血淋巴總蛋白含量，其水平變化反映了機體的營養(yǎng)狀態(tài)[8]。Chen等[9]認為pH的改變可能會影響機體蛋白質(zhì)代謝速率，從而導(dǎo)致血淋巴總蛋白含量降低。本試驗研究結(jié)果表明，試驗組血漿總蛋白含量呈上升趨勢。高pH下甲殼類動物將有毒的氨氮合成為無毒的氨基酸，儲蓄在血淋巴和肌肉中[10]，從而引起機體游離氨基酸和蛋白含量的增加。

溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性常用于評價機體免疫力。LZM可水解革蘭氏陽性細菌細胞壁的乙酰基多糖，從而抑制微生物生長，增強機體免疫力[11，12]。本試驗中兩種pH條件下血漿溶菌酶活力均沒有顯著變化，這與趙先銀等[13]在中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensiss)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)和日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)上的研究結(jié)果不符。這說明克氏原螯蝦對高pH有較強的適應(yīng)能力，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。ACP和AKP是肝胰腺中重要的磷酸單酯水解酶，在細胞吞噬、磷酸基團的轉(zhuǎn)移、機體蛋白質(zhì)的合成和鈣磷代謝等過程中發(fā)揮重要作用[14，15]。本試驗中，試驗組血漿AKP呈“M”型變化，ACP呈上升趨勢。分析原因可能是克氏原螯蝦為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而采取的一種主動防御措施，這也是一種被動的病理顯示[16]。高pH脅迫使克氏原螯蝦免疫機能受到一定抑制，磷酸酶活性上升有助于保護機體，減少氧化損傷。此外，本試驗中血漿酸性磷酸酶高于堿性磷酸酶，且二者達到峰值的時間點不一致，這是由于酸性磷酸酶參與機體死亡細胞的自溶作用[17]，凋亡細胞內(nèi)酸性磷酸酶活性偏高。

3.2 高pH脅迫對克氏原螯蝦應(yīng)激反應(yīng)的影響

應(yīng)激反應(yīng)是機體受到緊張性刺激物(應(yīng)激源)產(chǎn)生的保護性機制，應(yīng)激狀態(tài)下，蝦通過升高皮質(zhì)醇來降低合成代謝，加速分解代謝，以應(yīng)對環(huán)境的變化，同時增強糖代謝途徑來增強機體供能，導(dǎo)致血糖含量明顯升高[18]。適度的應(yīng)激對機體起到一定的保護作用，但過度的應(yīng)激反應(yīng)不利于傷口的愈合和免疫系統(tǒng)對抗病原，對機體的修復(fù)反而產(chǎn)生不利影響[19]。急性高pH引起克氏原螯蝦皮質(zhì)醇分泌增加，血漿皮質(zhì)醇含量增加，導(dǎo)致機體各組織對葡萄糖的利用率降低，機體能量供應(yīng)不足，為了應(yīng)對環(huán)境變化，機體增強糖代謝途徑來增強機體供能，肝臟糖的異生及肝糖原的分解加強[20]，血糖水平升高。隨著蝦滲透壓調(diào)節(jié)耗能的增加，血糖消耗加劇，因此在急性脅迫初期(12 h內(nèi))血糖含量維持在一個相對平衡的水平，而皮質(zhì)醇含量顯著升高。在短期的生理調(diào)整后，克氏原螯蝦適應(yīng)高pH環(huán)境，故高pH慢性脅迫時血漿血糖、皮質(zhì)醇含量降低。

3.3 高pH脅迫對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

在正常生理狀態(tài)下，動物體內(nèi)活性氧自由基(ROS)保持著動態(tài)平衡狀態(tài)，當受到應(yīng)激脅迫時，過多的活性氧自由基會促使機體內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成可對機體細胞造成損傷的MDA[21]。SOD能抑制活性氧自由基的形成，催化O2-生成過氧化氫(H2O2)[22]。GSH-Px可將H2O2分解為O2和H2O，阻止機體膜脂質(zhì)過氧化，減緩細胞所受氧化應(yīng)激損傷[23]。在脅迫12 h內(nèi)，試驗組克氏原螯蝦肝胰腺MDA、SOD水平與對照組相比差異不顯著，這說明急性應(yīng)激時克氏原螯蝦對高pH具有一定的抗逆性能和適應(yīng)能力，在脅迫初期機體抗氧化防御功能正常，可以有效清除活性氧自由基。由于長時間的高pH脅迫，克氏原螯蝦肝胰腺組織受損，抗氧化防御機能下降，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，故SOD活性下降，MDA含量上升。急性高pH脅迫促使肝胰腺中GSH-Px在短時間迅速下降，慢性脅迫時GSH-Px水平回升，推測可能是由于GSH-Px對pH刺激敏感，隨時間的延長，逐漸適應(yīng)高pH環(huán)境。由于SOD活性的短期下降，脂質(zhì)過氧化，GSH-Px活性升高，但表現(xiàn)出一定的滯后性，這說明不同酶指標變化響應(yīng)時間存在一定差異。不同時間點GSH-Px活性一直處于較高的水平，這是由于GSH-Px可單獨清除過氧化物[24]。

3.4 高pH脅迫對克氏原螯蝦鰓組織代謝酶活性的影響

4 結(jié)語

高pH急性脅迫對克氏原螯蝦有明顯的負面效應(yīng)，會對血漿、肝胰腺和鰓的免疫防御機制造成損傷，導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激。但克氏原螯蝦對高pH有一定的適應(yīng)性，隨著pH脅迫時間的進一步延長(高pH慢性脅迫)，機體的某些非特異免疫指標(AKP、GLU、CORTISOL、LDH)和抗氧化能力(SOD、GSH-Px、MDA)逐漸恢復(fù)。在養(yǎng)殖過程中，維持適宜、穩(wěn)定的pH有助于減少應(yīng)激，防控病害。