吳金平，楊代勤，杜 浩，羅 江，熊 偉，劉 源，朱建強(qiáng)，危起偉

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州，434025；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢， 430223)

鋅是動(dòng)物機(jī)體代謝中的一種重要營(yíng)養(yǎng)素，幾乎存在于所有的生物組織中[1]。鋅也是魚類必需的微量元素之一，其作為體內(nèi)100多種酶的組成成分或激活因子，參與核酸和蛋白質(zhì)的合成、能量代謝、氧化還原等生化代謝過(guò)程；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)激素、酶和生長(zhǎng)因子的活性及參與骨細(xì)胞核酸和蛋白質(zhì)的代謝進(jìn)而影響魚體的骨骼發(fā)育[2]。養(yǎng)殖魚類缺鋅會(huì)表征出生長(zhǎng)抑制、厭食、高死亡率、降低蛋白質(zhì)與碳水化合物的消化率、降低機(jī)體抵抗力與DNA損傷及氧化應(yīng)激一系列癥狀[3-8]。近些年，許多養(yǎng)殖魚類對(duì)飼料鋅的需要量已有研究，且不同的養(yǎng)殖魚類對(duì)飼料鋅的需要量也不一致，如部分草食性魚類飼料鋅需要量為32.6～190.39 mg/kg[2，9-10]、部分雜食性性魚類飼料鋅需要量為32.37～79.51 mg/kg[3，5，11]及部分肉食性魚類飼料鋅需要量為15.0～84.6 mg/kg[4，12-15]。關(guān)于養(yǎng)殖魚類對(duì)飼料鋅的需要量主要以增重率、鋅的蓄積量或其它生化指標(biāo)作為評(píng)判依據(jù)。脊椎動(dòng)物腸道微生物群落是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其數(shù)目龐大，種類繁雜，包含了各種各樣的細(xì)菌、真菌、古生菌及病毒[16]。已有研究表明納米氧化鋅離子投喂鯉(Cyprinuscarpio)6周后，處理組的Chao1平均數(shù)、Observed OTUs 平均數(shù)較對(duì)照組升高[17],而飼料鋅對(duì)魚類腸道微生物組成的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。

動(dòng)物腸道菌群具有影響和調(diào)節(jié)宿主腸道的多種功能，包括合成維生素，調(diào)節(jié)新陳代謝，營(yíng)養(yǎng)吸收，免疫系統(tǒng)發(fā)育及防止病原體定植等[18]。有學(xué)者提出調(diào)控養(yǎng)殖魚類腸道菌群是改善養(yǎng)殖魚類的飼料效率、生長(zhǎng)與健康的重要途徑之一[19]。Ring?等[20]報(bào)道一些魚類攝取益生元后，可以促進(jìn)其生長(zhǎng)與存活，有益于豐富腸道細(xì)菌，提高免疫反應(yīng)和降低對(duì)病原菌的敏感性?；诖?，本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序方法檢測(cè)分析了三種不同鋅處理水平的飼料投喂長(zhǎng)江鱘(Acipenserdabryanus)幼魚8周后，其腸道菌群多樣性及菌落結(jié)構(gòu)組成，以期從營(yíng)養(yǎng)與微生物學(xué)的角度探索飼料鋅是否對(duì)魚類腸道菌群多樣性及菌落結(jié)構(gòu)組成具有調(diào)控作用，從而為飼料鋅的合理添加提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 飼料制作

本實(shí)驗(yàn)采用酪蛋白-明膠、糊精與魚油、豆油作為實(shí)驗(yàn)飼料的蛋白源、糖源與脂肪源，其配方與營(yíng)養(yǎng)成分組成見(jiàn)表1。以ZnSO4·7H2O為鋅源，各組鋅添加濃度分別為0、40 和320 mg/kg 飼料，經(jīng)檢測(cè)各組實(shí)測(cè)值分別為14.77 mg/kg(A組)，57.71 mg/kg(B組) 和364.5 mg/kg(C組)飼料，檢測(cè)方法參照GB/T(13885-2017)，鋅的檢出限為5 mg/kg。飼料制作前，所有的干物質(zhì)原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)60目分級(jí)篩，按照飼料配方表分別稱取不同的原料，混勻。最后加20%左右的純凈水，待充分混勻后，用絞肉機(jī)加工制作成直徑4 mm的長(zhǎng)條圓形顆粒；飼料在室內(nèi)陰涼風(fēng)干后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方組成與營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖與樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用的長(zhǎng)江鱘幼魚來(lái)源于長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所太湖試驗(yàn)場(chǎng)當(dāng)年繁殖的子二代。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用基礎(chǔ)飼料投喂實(shí)驗(yàn)魚2周。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，隨機(jī)挑選初始體質(zhì)量為(52.88 ± 0.98)g，規(guī)格一致、體質(zhì)健壯的幼魚135尾分養(yǎng)于9個(gè)直徑105 cm，體積0.43 m3的養(yǎng)殖桶中，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15尾魚，飼養(yǎng)8周。采取表觀飽食法投喂，每日投喂3次。飼養(yǎng)期間的水溫為18.1～20.8 ℃，溶氧大于5 mg/L，pH為7.90～8.05，氨氮質(zhì)量濃度小于0.5 mg/L，養(yǎng)殖用水為經(jīng)過(guò)曝氣與過(guò)濾后的地下井水。每天測(cè)量水溫與溶氧，每天排污1次，每次排掉養(yǎng)殖桶中水體積的1/3。

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理隨機(jī)取5尾魚，測(cè)量體重、體長(zhǎng)與全長(zhǎng)(見(jiàn)表2)，麻醉，解剖后取出后腸，剝離后腸的糞，液氮速凍后立即置于-80 ℃冰箱保存。

表2 實(shí)驗(yàn)魚的體重與體長(zhǎng)(N=5，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

1.3 樣本DNA提取，PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序

將保存好的樣品送往武漢邁維代謝生物科技公司進(jìn)行樣品DNA提取、建庫(kù)和16S rRNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序。流程為：利用16S V3-V4變異區(qū)引物(515F-806R)對(duì)提取樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物；使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，經(jīng)截去Barcode和引物序列后使用FLASH[21]對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags；拼接得到的Raw Tags經(jīng)過(guò)濾處理[22]得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，參照Qiime[23]的Tags質(zhì)量控制流程操作。經(jīng)過(guò)處理后得到的Tags需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(guò)(https://github.com/torognes/vsearch/)[24]與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse軟件[25]對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時(shí)選取OTUs的代表性序列。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[26]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[27]進(jìn)行物種注釋分析。使用Qiime軟件計(jì)算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用IBM 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析(one-wany ANOVA)和Duncan’s均值多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示

2 結(jié)果

2.1 飼料鋅對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道α-多樣性的影響

從表3可知，飼料鋅對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道α-多樣性產(chǎn)生了影響，且所有樣品的Good＿coverage(覆蓋率)均在0.995 4以上，表明本次實(shí)驗(yàn)中各處理組的樣品微生物種類均已檢測(cè)到。隨著飼料鋅水平的升高，ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)與Observed species指數(shù)出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，三種指數(shù)均在飼料鋅364.5 mg/kg時(shí)最低，364.5 mg/kg組與14.77 mg/kg組之間差異顯著，與57.71 mg/kg組之間無(wú)顯著差異。香濃指數(shù)、辛普森指數(shù)與PD-whole tree值也表現(xiàn)出隨飼料鋅水平的升高而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且三種指數(shù)均在364.5 mg/kg時(shí)最低，但各組之間無(wú)顯著性差異。

表3 飼料鋅對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道α-多樣性的影響

2.2 飼料鋅對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道菌群群落結(jié)構(gòu)組成的影響

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在科水平下， A、B、C處理組梭桿菌科分別占到了37.55%、32.44%、42.63%，表明飼料中鋅含量達(dá)到364.5mg/kg時(shí)，長(zhǎng)江鱘幼魚后腸的梭桿菌科的相對(duì)豐度最高。腸桿菌科分別占到了11.24%、41.56%、36.93%，表明飼料中鋅含量達(dá)到57.71 mg/kg時(shí)，長(zhǎng)江鱘幼魚后腸的腸桿菌科的相對(duì)豐度最高。隨飼料鋅水平的升高，梭菌科類的百分比出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)14.77 mg/kg組的百分比值最高為32.03%，而B(niǎo)、C處理組中分別占到了18.90%、13.80%。上述3個(gè)科在A、B、C 3個(gè)處理組中分別占80.82%、92.89%、93.37%，表明在不同鋅飼料處理水平下，上述3個(gè)科在魚類腸道菌群的組成中占據(jù)了優(yōu)勢(shì)。同樣發(fā)現(xiàn)，希萬(wàn)氏菌科在A、B、C 3個(gè)處理組中分別占2.04%，0.21%，0.62%，且隨著飼料鋅水平的增加而出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。而相對(duì)豐度不在前10的科中，其他的科在A、B、C 3個(gè)組分別占9.15%，3.86%，5.21%。綜上可知，飼料中鋅含量不同對(duì)細(xì)菌科的組成有影響。

圖1 科水平下不同處理組長(zhǎng)江鱘幼魚腸道菌群組成的相對(duì)豐度

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，在屬水平下，A、B、C處理組鯨桿菌屬分別占到了31.28%、27.57%，35.71%；梭菌屬類分別占到了36.87%，18.55%，14.05%；鄰單胞菌屬分別占到了8.76%，33.60%，18.92%；檸檬酸桿菌屬分別占到了1.42%，1.84%，20.60%；上述4種細(xì)菌屬總和百分比分別達(dá)78.32%，81.56%，89.28%，表明這4種細(xì)菌屬是優(yōu)勢(shì)屬。在前10種細(xì)菌屬之外的屬中，A、B、C 3個(gè)處理組，分別占到了14.28%，14.44%，8.96%，上述結(jié)果表明飼料中鋅含量的不同也會(huì)對(duì)細(xì)菌屬的比例組成產(chǎn)生顯著影響。

圖2 屬水平下不同處理組長(zhǎng)江鱘幼魚腸道菌群組成的相對(duì)豐度

2.3 飼料鋅對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道OTU數(shù)量的影響

從圖3可知，不同鋅處理下的飼料對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道OTU數(shù)量產(chǎn)生了顯著影響。A、B、C處理組中總OTU數(shù)量隨飼料鋅含量的上升出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。其中，A、B、C 3個(gè)處理組中總OTU數(shù)分別為1 160，790，654。A與B組共有的OUT數(shù)為622；B與C組共有的OUT數(shù)為400；A與C組共有的OUT數(shù)為510；A、B、C 3個(gè)處理組共有的OUT數(shù)為371。

圖3 不同鋅飼料處理下的OTU分布

3 討論

魚體腸道微生物對(duì)魚的大小、代謝、攝食行為及免疫反應(yīng)都有影響[28]；同時(shí)腸道菌群對(duì)腸道形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)吸收及代謝機(jī)制有著重要影響，有益菌與有害菌的動(dòng)態(tài)平衡及正常分布與否是保證宿主能否健康生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)[29]。因此，維持魚體健康的腸道菌群，對(duì)于養(yǎng)殖魚類的健康生長(zhǎng)有著重要的意義。Alpha多樣性用于分析樣本內(nèi)(Within-community)的微生物群落多樣性[30]，通過(guò)單樣本的Alpha 多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同鋅含量的飼料對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道菌群的ACE、Chao1與Observed species 指數(shù)均產(chǎn)生了顯著影響，3種指數(shù)均表現(xiàn)出隨飼料鋅含量的增加而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且低劑量與高劑量鋅處理組差異顯著，這表明腸道菌群的豐富度受到飼料鋅含量的影響，特別是飼料高劑量鋅組的腸道菌群豐富度明顯下降，表明飼料鋅含量過(guò)高不利于魚類腸道健康，與Chuapani等[17]報(bào)道納米氧化鋅離子投喂鯉6周后處理組的Chao1平均數(shù)、Observed OTUs 平均數(shù)較對(duì)照組升高的研究結(jié)果不一致，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致可能與處理物質(zhì)的類型及濃度、實(shí)驗(yàn)對(duì)象的種類與規(guī)格、實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間、養(yǎng)殖環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)條件等是否一致而密切有關(guān)。鱘魚營(yíng)養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，不同的鱘類攝食相同的飼料，其腸道菌群的豐富度與多樣性也是不一致的[31]，表明了每種特定的魚類可能有著獨(dú)有的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)。本次實(shí)驗(yàn)中，Shannon、Simpson與PD-whole tree等指數(shù)的趨勢(shì)均是降低的，但與對(duì)照組相比差異不明顯，表明本次實(shí)驗(yàn)中飼料鋅含量還不足以對(duì)上述3種腸道菌群的多樣性指數(shù)產(chǎn)生顯著性影響。

測(cè)序結(jié)果顯示，在科水平上排名前10的梭桿菌科、腸桿菌科與梭菌科3個(gè)科的總和百分比在不同鋅含量的飼料組分別達(dá)到了80.82%、92.89%、93.37%，表明不同鋅處理水平下腸道核心的菌落種群結(jié)構(gòu)并未發(fā)生大的變化。阮瑞等[32]對(duì)人工養(yǎng)殖達(dá)氏鰉(Husodauricus)幼魚腸道菌群組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)梭菌科占科分類中的98.137%，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了少量的梭桿菌科與腸桿菌科。Geraylou等[19]在關(guān)于西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)投喂阿拉伯木聚糖寡糖實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了梭桿菌科與梭菌科，并且發(fā)現(xiàn)魚攝食含阿拉伯木聚糖寡糖的飼料后梭桿菌科的豐度是降低的，而梭菌科的豐度是上升的，這些結(jié)果表明梭桿菌科、腸桿菌科與梭菌科是鱘魚腸道菌落中比較重要的科之一，其百分占比可能因飼料營(yíng)養(yǎng)與養(yǎng)殖環(huán)境不同而表現(xiàn)出異同性。進(jìn)一步在屬水平上分析發(fā)現(xiàn)，鯨桿菌屬、梭菌屬類、鄰單胞菌屬與檸檬酸桿菌屬等4種細(xì)菌屬總和百分比分別達(dá)78.32%，81.56%，89.28%，表明這4種細(xì)菌屬可能是優(yōu)勢(shì)屬。Han等[33]報(bào)道的鯨桿菌屬是肉食性魚類主要的屬之一，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符；同時(shí)有研究表明，屬的水平上草食性魚類腸道中主要以具有降解纖維素功能的梭菌屬、檸檬酸桿菌屬和纖毛菌屬(Leptotrichia)為主[33]，本研究中梭菌屬與檸檬酸桿菌屬也是長(zhǎng)江鱘幼魚腸道菌優(yōu)勢(shì)屬之一，這主要與鱘魚是一種雜食偏肉食的食性而密切有關(guān)。在前10種細(xì)菌屬之外的屬中，3個(gè)處理組分別占到了14.28%，14.44%，8.96%，表明了飼料中鋅達(dá)到一定水平時(shí)(364.5 mg/kg)會(huì)影響腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)。另外通過(guò)venn圖發(fā)現(xiàn)不同鋅處理下的飼料對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚腸道OTU數(shù)量產(chǎn)生了影響，隨飼料鋅含量的增加，長(zhǎng)江鱘幼魚腸道OTU數(shù)量從1 160下降到654；而三種飼料鋅處理下三個(gè)組共有的OTU數(shù)為371個(gè)，占三者總和的25.71%，這表明在相同養(yǎng)殖環(huán)境下，長(zhǎng)江鱘幼魚后腸腸道菌群的相似性受飼料鋅處理的影響比較大；這與水曉梅等[34]報(bào)道的大豆?jié)饪s蛋白對(duì)大黃魚生長(zhǎng)和腸道微生物菌落的影響中大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉為0%、25%與100%時(shí)三者共有的OTU數(shù)為64個(gè)，占三者總數(shù)的68.08%的結(jié)果不一致。