魯翠云，杜雪松，鄭先虎，李 超，程 磊，孫志鵬，孫效文，陳 忠

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 530021)

鯉(CyprinuscarpioL.)在我國(guó)具有悠久的養(yǎng)殖和選育歷史，形成了許多極具地方特色的優(yōu)良種質(zhì)，禾花鯉就是華南一帶適合稻田養(yǎng)殖的特色地方種質(zhì)，因其在稻田中養(yǎng)殖，采食落水禾花而得名。經(jīng)過長(zhǎng)期的環(huán)境適應(yīng)和定向選育，不同區(qū)域又選育出了不同的禾花鯉地方品系，例如桂林品系、華南鯉、石鯉等，普遍具有的特點(diǎn)是頭小腹圓、不善跳躍、易捕撈，適合稻田養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境[1]。近幾年，稻漁綜合種養(yǎng)模式在全國(guó)迅速推廣，2018年已經(jīng)有27個(gè)省份開展了稻漁綜合種養(yǎng)，水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)到233萬噸，比2017年增加了19.81%，其中以鯉、鯽為主養(yǎng)魚類的稻田養(yǎng)魚占42.10%[2]。金邊鯉(Cyprinuscarpiovar.Jinbian，暫定名)是由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心聯(lián)合多家單位針對(duì)稻田養(yǎng)殖從融水田鯉中選育出的禾花鯉新品系，因背鰭兩側(cè)從頭部頂端到尾部的皮膚為金色，似一條金邊而得名，具有肉多刺柔、肉質(zhì)鮮美、無腥味等特點(diǎn)[3]，研究表明稻田養(yǎng)殖金邊鯉的肌肉品質(zhì)優(yōu)勢(shì)明顯[4]，市場(chǎng)價(jià)格較高，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)開發(fā)前景。

在品種選育和使用過程中注重對(duì)遺傳多樣性的保護(hù)，最大限度地避免近親繁殖不僅能夠優(yōu)化種群結(jié)構(gòu)、提高生產(chǎn)性能，還能夠延長(zhǎng)選育品種的使用壽命。因此，對(duì)親本群體進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估，制定有效的繁殖配組策略就成為重點(diǎn)。基于親本間遺傳距離的鯉分子育種技術(shù)已經(jīng)開發(fā)多年，其中以微衛(wèi)星標(biāo)記計(jì)算的遺傳距離指導(dǎo)家系和群體選育已經(jīng)在鯉[5,6]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[7]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[8]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[10]等選育中進(jìn)行了應(yīng)用，取得了良好的選育效果。研究表明隨著親本間遺傳距離的增加，家系平均體質(zhì)量等生長(zhǎng)性狀呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，選擇遺傳距離中等的親本更易于獲得優(yōu)良家系[5]；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，選育親本群體雌、雄個(gè)體間遺傳距離也呈現(xiàn)出正態(tài)分布的特點(diǎn)，選擇遺傳距離中間值作為配組的依據(jù)切實(shí)可行[11]?；诜肿訕?biāo)記的遺傳距離預(yù)測(cè)子代的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)在農(nóng)作物開展的研究較多，研究表明使用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的功能基因標(biāo)記或QTL標(biāo)記計(jì)算遺傳距離能夠增強(qiáng)預(yù)測(cè)效果[12,13]。然而，以往在評(píng)估鯉親本個(gè)體間遺傳差異時(shí)，使用的多為隨機(jī)多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記，缺乏與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)性。隨著鯉基因組資源的開發(fā)[14]，與生長(zhǎng)性狀緊密連鎖的QTL標(biāo)記已經(jīng)積累了很多，其中不乏在鯉品種間共享的QTL標(biāo)記[15,16]。本研究用24個(gè)與體質(zhì)量、體長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL標(biāo)記對(duì)金邊鯉親本群體進(jìn)行遺傳評(píng)估，分析雌、雄個(gè)體間的遺傳距離分布，為金邊鯉的繁殖配組及持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從廣西壯族自治區(qū)融水地區(qū)收集背鰭兩側(cè)從頭部頂端至尾鰭基部有完整金色鱗片的個(gè)體組成金邊鯉基礎(chǔ)群體，養(yǎng)殖于廣西農(nóng)業(yè)良種海南南繁育種基地。選擇體形勻稱、無傷病且性腺發(fā)育良好的個(gè)體192尾組成親魚群體，其中雌性個(gè)體86尾，雄性個(gè)體106尾。對(duì)每尾親魚植入電子標(biāo)記，記錄每個(gè)樣本電子標(biāo)記號(hào)，并剪取部分鰭條組織，編號(hào)后置于濾紙晾干，以備提取基因組DNA[17]。

1.2 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選

從鯉高密度連鎖圖譜及鏡鯉生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的QTL標(biāo)記中篩選24個(gè)用于金邊鯉親本群體的遺傳分析[14,15]。這些標(biāo)記分布于11個(gè)連鎖群，其中2個(gè)連鎖群含有鏡鯉與建鯉共享QTL區(qū)間，12個(gè)標(biāo)記是鏡鯉與建鯉共享QTL標(biāo)記[15]，在鯉種間具有較好的保守性和適用性(表1)。

表1 鯉QTL標(biāo)記所在連鎖群與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

用組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物)從鰭條組織中提取金邊鯉基因組DNA，紫外分光光度計(jì)定量后稀釋成50 ng/μL。采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)192個(gè)樣本的基因型，在正向引物的5′端標(biāo)記藍(lán)色(FAM)、綠色(HEX)或黃色(TAMRA)熒光，PCR反應(yīng)體系含有10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、0.2 mmol/L上下游引物、1 U Taq DNA聚合酶及100 ng DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，各取0.7 μL的三色熒光PCR產(chǎn)物(共2.1 μL)，5.9 μL的Hi-DiTM甲酰胺和0.1 μL LIZ-500制備成電泳混合樣。將混合樣置于PCR儀上于95 ℃變性5 min，立即置于冰上冷卻5 min，在3730XL遺傳分析儀(ABI)上進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，電泳結(jié)束后利用GeneMap-per V4.1軟件進(jìn)行圖像收集和數(shù)據(jù)分析，建立個(gè)體基因型檔案。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件“魚類種質(zhì)資源遺傳分析裝置(ZL200710144749.3)”進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，用PopGene32(Version 3.2)軟件計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率(P)、等位基因數(shù)(No)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC)按照Botstein等[18]的方法計(jì)算，公式如下：

其中，n為某一位點(diǎn)上等位基因數(shù)，Pi、Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率，j=i+1。

用GenePop(Version 4.7)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)估計(jì)群體Hardy-Weinberg平衡偏離。用PopGene32軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)群體的近交系數(shù)(Fis)，近交系數(shù)為正值表明群體在該位點(diǎn)雜合子缺失，負(fù)值表明該位點(diǎn)雜合子過剩。用NeEstimator(version 2.1)軟件采用連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)方法估算有效群體大小。

運(yùn)行PHYLIP(version3.695)軟件的gendist程序，計(jì)算兩兩雌、雄個(gè)體間的遺傳距離，用neighbor程序繪制基于鄰接法(neighbor joining method，NJ)的聚類圖，劃分繁殖組，并用Arlequin 3.11軟件中的分子方差分析(AMOVA)計(jì)算繁殖組間的遺傳變異組成及兩兩繁殖組間的遺傳分化系數(shù)(Fst)。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增情況

24個(gè)QTL標(biāo)記在金邊鯉親本群體擴(kuò)增獲得清晰、穩(wěn)定的條帶，并在個(gè)體間表現(xiàn)出多態(tài)性。擴(kuò)增的片段大小為100～310 bp，各標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)(No)在4個(gè)(HLJ3579)到12個(gè)(HLJ1944)之間，共檢測(cè)到184個(gè)等位基因，群體平均等位基因數(shù)為7.667個(gè)。根據(jù)Botstein等[18]對(duì)標(biāo)記多態(tài)水平的劃分標(biāo)準(zhǔn)，22個(gè)標(biāo)記為高度多態(tài)(PIC≥0.5)，只有HLJ2300和CAFS882分別為中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.5)和低度多態(tài)(PIC<0.25)水平的標(biāo)記。

2.2 親本群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用24個(gè)QTL標(biāo)記分析了金邊鯉親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.170～7.132，平均為3.941；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.156～0.859，平均為0.590；期望雜合度(He)為0.146～0.862，平均為0.707；多態(tài)信息含量(PIC)為0.138～0.845，平均為0.670，結(jié)果顯示金邊鯉親本群體處于高度多態(tài)水平(PIC≥0.5)。

對(duì)金邊鯉親本群體進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡評(píng)估，結(jié)果經(jīng)Bonferroni校正顯著性閾值后，群體尚有10個(gè)位點(diǎn)顯著或極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，其中HLJ2456、HLJ3271、HLJ2387等9個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子極顯著缺失(P<0.000 4)。群體近交系數(shù)能夠直觀地表現(xiàn)出雜合子的缺失或過剩，結(jié)果群體在19個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)雜合子不同程度的缺失，占79.17%；僅5個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子過剩。采用LD方法估算金邊鯉親魚有效群體大小為113.6尾(CI95%)。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。

表2 金邊鯉親本群體在24個(gè)QTL標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)

續(xù)表2

2.3 親本群體雌雄個(gè)體間遺傳距離分布及繁殖組間的遺傳分化

用24個(gè)QTL標(biāo)記分析了金邊鯉親本群體雌、雄個(gè)體間的遺傳距離分布，結(jié)果雌、雄個(gè)體間遺傳距離位于0.1231～1.8563之間，遺傳距離呈正態(tài)分布，其中峰值位于0.7～0.9之間，占38.36%(圖1)?；趥€(gè)體間遺傳距離的NJ聚類圖將親本個(gè)體聚為5個(gè)大小不等的分支，顯示出群體內(nèi)出現(xiàn)一定程度的遺傳分化(圖2)，結(jié)合育種實(shí)際將親本群體劃分為3個(gè)繁殖組，Group I包含24尾雌魚和36尾雄魚；Group II包含34尾雌魚和50尾雄魚；Group III包含28尾雌魚和20尾雄魚。

圖1 金邊鯉親本群體雌、雄個(gè)體間遺傳距離分布圖

圖2 金邊鯉親本群體基于NJ算法的個(gè)體間聚類圖

對(duì)3個(gè)繁殖組進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果2.67%的遺傳變異來自繁殖組間(表3)。繁殖組間遺傳分化系數(shù)為0.025 48(Group II和Group III)～0.035 09(Group I和Group III)，兩兩繁殖組間的遺傳分化系數(shù)均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

表3 繁殖組間遺傳變異的分子方差分析

3 討論

3.1 關(guān)于金邊鯉親魚群體的遺傳多樣性問題

本研究用24個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL標(biāo)記分析金邊鯉親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化，結(jié)果群體平均等位基因數(shù)(No=7.667)顯著高于有效等位基因數(shù)(Ne=3.941)，表明群體在生長(zhǎng)性狀相關(guān)的位點(diǎn)還沒有顯著受到選擇育種的影響，仍然保持了豐富的稀有等位基因，在生長(zhǎng)性狀相關(guān)位點(diǎn)尚未顯示出明顯的富集效應(yīng)。群體平均觀測(cè)雜合度(Ho=0.590)顯著低于期望雜合度(He=0.707)，表明群體已經(jīng)出現(xiàn)了一定比例的雜合子缺失。Hardy-Weiberg平衡檢驗(yàn)近交系數(shù)的結(jié)果也表明：群體在19個(gè)(79.17%)QTL位點(diǎn)出現(xiàn)不同程度的雜合子缺失，9個(gè)(37.50%)位點(diǎn)出現(xiàn)極顯著的雜合子缺失，顯示出人工選擇的跡象。群體多態(tài)信息含量能夠直觀地反映出群體遺傳多樣性水平，按照Botstein等[18]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，金邊鯉親本群體處于高度多態(tài)水平(PIC=0.670>0.5)，遺傳多樣性較好，具備進(jìn)一步生產(chǎn)及選育優(yōu)良品種的遺傳潛力，同時(shí)也體現(xiàn)出金邊鯉主要以外形為選育目標(biāo)，而以生長(zhǎng)為目標(biāo)的選育尚未完成。

潘賢輝等[19]用mtDNA分析的結(jié)果表明金邊鯉與禾花鯉桂林品系和野鯉分化顯著，且遺傳多樣性低于二者。甘寶江等[20]用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的分析結(jié)果表明：雖然金邊鯉群體處于高度多態(tài)水平，但是卻低于黑龍江和太湖野生鯉群體、福瑞鯉和建鯉等養(yǎng)殖群體，且與兩者具有中等程度的遺傳分化。本研究用QTL標(biāo)記計(jì)算的金邊鯉群體5項(xiàng)遺傳參數(shù)均低于甘寶江等[20]的分析結(jié)果，分析原因一方面QTL標(biāo)記因與性狀緊密連鎖而具有較高的保守性，多態(tài)性水平相對(duì)較低；另一方面群體遺傳多樣性的分析結(jié)果不僅受群體遺傳背景的影響，樣本量、標(biāo)記數(shù)量、標(biāo)記多態(tài)性水平、標(biāo)記類型、分型技術(shù)等因素也對(duì)分析結(jié)果具有較大的影響[21,22]。朱華平等[23]的研究發(fā)現(xiàn)華南鯉F5的遺傳多樣性低于地方品種，且隨著選育世代的增加，遺傳多樣性參數(shù)呈現(xiàn)逐代下降的趨勢(shì)[24]，其中F5平均等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量較F1分別降低了28.17%和15.36%，認(rèn)為人工選育加快了華南鯉選育品種與地方品種的遺傳分化，也導(dǎo)致了選育品種遺傳多樣性下降。因此，金邊鯉在選育過程中，要特別注意對(duì)選育親魚群體遺傳多樣性的保護(hù)，以提高選育效率，保持良種的生產(chǎn)性能，延長(zhǎng)良種的使用壽命。

3.2 關(guān)于親本間遺傳距離分布規(guī)律及配組問題

基于分子標(biāo)記估算的親本遺傳差異指導(dǎo)繁殖配組的育種技術(shù)已經(jīng)開發(fā)了成套的選育種軟件[25]，在多個(gè)物種的推廣應(yīng)用中取得了良好的選育效果。面對(duì)龐大的基因組資源，如何選擇標(biāo)記用于遺傳背景的評(píng)估是需要考慮的問題。以往的研究對(duì)標(biāo)記的選擇多帶有隨機(jī)性，然而，由于微衛(wèi)星標(biāo)記遍布整個(gè)基因組，隨機(jī)選擇微衛(wèi)星標(biāo)記計(jì)算的遺傳距離雖然能夠反映親本間的遺傳差異，但是卻不能反映親本間在目標(biāo)性狀的遺傳差異，而大量與研究目標(biāo)性狀無關(guān)的位點(diǎn)也將稀釋遺傳距離與目標(biāo)性狀間的相關(guān)性。

本研究參考周康奇等[26]的研究結(jié)果，用鯉體質(zhì)量、體長(zhǎng)、體高和體厚4個(gè)性狀的QTL標(biāo)記評(píng)估了金邊鯉親本間遺傳距離，提高以生長(zhǎng)性狀為目標(biāo)的選配效率。結(jié)果雌、雄個(gè)體間遺傳距離呈正態(tài)分布，峰值位于0.7～0.9，高于鏡鯉和豫選黃河鯉[5,11]，低于福瑞鯉和半滑舌鰨[10,11]。綜合以上幾種魚類親本個(gè)體間遺傳距離的分布發(fā)現(xiàn)：個(gè)體間遺傳距離呈正態(tài)分布，與子代生長(zhǎng)性狀隨親本遺傳距離增大先升高后下降的趨勢(shì)相似；遺傳距離的正態(tài)分布曲線是變動(dòng)的，個(gè)體間遺傳距離的大小不僅取決于群體的遺傳背景，同樣還受到樣本量大小、標(biāo)記的多態(tài)性、標(biāo)記類型以及檢測(cè)技術(shù)的影響。本研究用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)對(duì)金邊鯉親本群體進(jìn)行基因型分析，提高了分型的準(zhǔn)確性，也會(huì)使群體的遺傳多樣性高于垂直版聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)的分析結(jié)果；選取峰值臨近的2個(gè)遺傳距離范圍作為繁殖閾值切實(shí)可行，一方面可以避免近親交配，另一方面可以最大限度地?cái)U(kuò)大親本的可選擇性，提高配組效率。

金邊鯉的種源(廣西融水田鯉)組成復(fù)雜[3]，加之其選育時(shí)間較短，因此群體遺傳多樣性較高，個(gè)體間遺傳距離較大?；谶z傳距離的聚類圖也顯示出明顯的呈簇分支，依據(jù)聚類圖劃分的繁殖組間的遺傳分化系數(shù)也達(dá)到顯著水平，表明群體來源的復(fù)雜性和差異性。選擇不同遺傳距離范圍的親本個(gè)體繁殖3個(gè)禾花鯉家系進(jìn)行網(wǎng)箱生長(zhǎng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果來源于不同繁殖組且位于遺傳距離閾值的家系生產(chǎn)性能最佳[27]。據(jù)此，建議金邊鯉家系繁殖配組時(shí)，宜從不同繁殖組選擇個(gè)體間遺傳距離位于最佳“閾值”0.7～0.9之間的個(gè)體作為親本；群體繁殖時(shí)，宜繁殖組間雌、雄交叉配組，有助于提高群體的生產(chǎn)性能、保持群體的遺傳多樣性水平。