歐陽美，張曉宇，張富鐵，劉煥章

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所，中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護重點實驗室，武漢 430072；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)，俗稱草鯇、草棒，屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)雅羅魚亞科(Leuciscinae)草魚屬(Ctenopharyngodon)，與青魚(Mylopharyngodonpiceus)、鰱(Hypophthalmictuthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)并稱為我國的“四大家魚”。草魚在我國其廣泛分布于長江中下游江河湖泊水域，是我國重要的的淡水魚類資源[1]。

在水利工程建設(shè)、環(huán)境污染、過度捕撈等多重作用下，草魚自然資源逐漸衰退，主要表現(xiàn)在性早熟、成熟個體趨小、生長過緩、抗病抗逆性差等方面，因此其種質(zhì)資源保護備受人們重視[2]。物種種質(zhì)資源的保護需要評估其種質(zhì)現(xiàn)狀，最重要的是了解物種種群的遺傳多樣性水平。遺傳多樣性是物種繁衍、抵抗疾病和適應(yīng)環(huán)境變化的物質(zhì)基礎(chǔ)；遺傳結(jié)構(gòu)反映了物種遺傳變異的時空分布格局[3]。目前已有部分學(xué)者對草魚群體遺傳學(xué)方面做了相關(guān)的研究，例如汪煥等[4]和季曉芬等[5]利用微衛(wèi)星標記對長江草魚進行分析，發(fā)現(xiàn)長江草魚群體的遺傳多樣性水平總體較高；汪煥等[4]發(fā)現(xiàn)4個養(yǎng)殖場的草魚均存在近親繁殖現(xiàn)象。

近年來，線粒體DNA Cytb基因，其進化速度適中、變異率相對較高，已作為探討種間、種內(nèi)遺傳和分化變異的優(yōu)良標記[6]，被廣泛應(yīng)用于魚類等動物的種群分化、系統(tǒng)發(fā)育等方面[7]。朱葉[2]、李樹華等[8]、朱秀芳[9]以及翟東東等[10]通過線粒體Cytb基因序列對長江流域多個地點草魚遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果均顯示草魚的遺傳多樣性較低，且群體間無差異；李思發(fā)等[11]同樣利用線粒體基因標記分析長江流域四大家魚遺傳多樣性，顯示草魚遺傳多樣性水平較低；而馬琴[12]則基于線粒體Cytb基因序列分析三峽庫區(qū)草魚種群遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)庫區(qū)草魚種群遺傳多樣性較豐富。

已有研究存在采樣點單一、采樣范圍小，群體數(shù)量少等問題，不能有效反映草魚在長江中上游主要區(qū)域種質(zhì)變化情況，同時缺乏對養(yǎng)殖群體的廣泛研究。因此，本研究對長江中上游草魚主要養(yǎng)殖地進行了全面的本底調(diào)查研究，旨從分子水平上探討草魚野生和養(yǎng)殖群體遺傳差異，全面掌握草魚野生和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀；評估草魚群體種質(zhì)資源狀況，分析養(yǎng)殖群體種質(zhì)衰退情況，為草魚種質(zhì)資源評價、開發(fā)利用及良種選育提供更為全面的遺傳資料和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共采集到長江中上游地區(qū)(圖1)14個地點22個群體的草魚樣本(包括親魚鰭條、肌肉和魚苗)，地點從西往東依次是木洞(MD)、萬州(WZ)、荊州窯灣(YW)、石首原種場(SS)、荊州鑼場(LC)、蔡甸康祥(CD)、漲渡湖(ZDH)、保安湖(BAH)、黃州幸福漁業(yè)合作社(HZ)、陽新百容良種有限公司(YX)、浠水水產(chǎn)良種場(XS)、蘄春正大水產(chǎn)(QC)、瑞昌原種場(RC)、鄱陽湖(PYH)。采集的草魚樣品置于95%乙醇中保存，帶回實驗室提取基因組 DNA，樣品來源及數(shù)量情況見表1。

表1 長江中上游草魚采樣情況

圖1 長江中上游草魚采樣點

1.2 基因組DNA的提取和檢測

本實驗采用高鹽抽提法[13]提取DNA。DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照確認質(zhì)量后，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及序列測定

Cytb擴增和測序的引物為通用引物L(fēng)14724：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[14]，引物由武漢天一輝遠生物有限公司合成。擴增反應(yīng)在25 μL的體系下進行：模板DNA 50 ng；2×PCR Mix 12.5 μL(包含Taq酶2.5 U，dNTPs 10 μmol，MgCl20.1 mmol)，上、下游引物(10 μmol /L)各1 μL，其余體積用雙蒸水補足。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)35個循環(huán)后再72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗證后，將目的條帶準確清晰擴增出來的樣品送生工生物工程股份有限公司，利用正反引物進行雙向測序。

1.4 DNA序列數(shù)據(jù)的整理與分析

參照測序峰圖，對序列進行編輯和校正，查驗無錯漏后，經(jīng)NCBI BLAST程序確認為草魚序列后，再使用MEGA7[15]軟件進行多重序列比對；同時計算堿基含量、轉(zhuǎn)換/顛換比率，分析序列變異位點等序列特征；同時基于Tajima-Nei模型計算群體間的遺傳距離，構(gòu)建UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic average)系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Kimura雙參數(shù)距離模型以鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建單倍型間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系樹，所有的計算均采用了1 000次的重復(fù)。使用DnaSP5.1[16]軟件計算各地理種群的多態(tài)位點(S)、單倍型數(shù)目(H)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)等。通過Network軟件[17]中的Median Joining法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。使用Arlequin3.1軟件[18]計算遺傳分化系數(shù)Fst，同時進行中性檢驗來驗證群體在歷史上是否發(fā)生過種群擴張。

2 結(jié)果

2.1 草魚群體細胞色素b基因序列變異分析

草魚677個個體均獲得長度為1 008 bp的同源序列，養(yǎng)殖和野生群體的堿基組成無差異，其中堿基 C 的含量顯著低于其他堿基的含量，兩者的A+T和G+C含量一樣，且A+T(58.5%)明顯大于G+C(41.5%)，存在一定的堿基組成偏倚性，這與線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的特點相符。養(yǎng)殖和野生群體檢測到多態(tài)位點分別為27、22，其中單突變位點分別為16、12，簡約信息位點分別為11、10，均無堿基插入或缺失，兩者的轉(zhuǎn)換顛換均未達飽和，轉(zhuǎn)換數(shù)大于顛換數(shù)，其比值分別是3.67、1.45。

2.2 單倍型關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育分析

677條序列檢測出35種單倍型(Hap_1-Hap_35)，包括12個共享單倍型，23個獨有單倍型。23個獨有單倍型中，野生群體占5個，其余獨有單倍型為養(yǎng)殖群體所有。在所有單倍型中，Hap_1和Hap_2兩種單倍型在群體間分布最廣，與其他單倍型關(guān)系緊密，為所有群體共享，其中頻率最高的是Hap_1，出現(xiàn)290次，頻率達0.428 4，其次是Hap_2，頻率達0.344 2。草魚各野生群體單倍型數(shù)在4～11之間，原種場和苗種場各養(yǎng)殖群體單倍型數(shù)在2～7(表2)。

基于Cytb基因序列的草魚群體的單倍型數(shù)據(jù)，以草魚(登錄號：HM237990.1)為標準序列，以鰱(登錄號：MH797122.1)、青魚(登錄號：MF687137.1)以及鳙(登錄號：HM162839.1)作為外類群，采用鄰接法構(gòu)建單倍型間分子系統(tǒng)樹，從圖2可以看出野生和養(yǎng)殖群體各單倍型混雜在一起，沒有形成明顯的獨立分支，并且與外類群分開。

圖2 基于Cyt b序列單倍型構(gòu)建的草魚NJ樹

2.3 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖譜的構(gòu)建

Network軟件生成的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)能夠直觀地展現(xiàn)出35種單倍型之間的關(guān)系。其中H_1和H_2單倍型位于網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的擴展中心，兩單倍型為所有草魚群體所共享，為主體單倍型，與其他單倍型短支相連，可以推測H_1和H_2兩種單倍型在這一單倍型組中相對較為原始，周圍的單倍型由其衍生而來。草魚群體的單倍型在各部分均有分布，沒有產(chǎn)生明顯的譜系分化。

圖3 草魚各單倍型間的進化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 草魚野生和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

各群體遺傳多樣性參數(shù)見表2，草魚野生群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均值(Hd:0.769;Pi:0.001 43)均高于原種場和苗種場養(yǎng)殖群體均值(Hd:0.766;Pi:0.001 13)/(Hd:0.649;Pi:0.000 84)。野生群體中，WZ群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平高于MD和PYH群體(Hd:0.857 vs 0.778 vs 0.717;Pi:0.002 05 vs 0.001 52vs 0.001 05)，且其是所有檢測群體中多樣性水平最高的。QSS和QRC原種場養(yǎng)殖親魚單倍型和核苷酸多樣性均高于其人工養(yǎng)殖魚苗的多樣性，略低于野生群體。

表2 基于Cyt b基因的草魚群體遺傳多樣性分析

苗種場群體中，YX群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(Hd:0.791;Pi:0.001 47)是所有苗種場檢測群體中最高的，另外，HZ、ZDH、QC2以及QC3群體的多樣性水平也較高，其余苗種場群體的多樣性均低于苗種場群體總體多樣性水平，其中最低的是CD1群體(Hd:0.247;Pi:0.000 24)。

苗種場大部分群體多樣性水平偏低，尤其是CD三個批次魚苗的遺傳多樣性均很低(Hd:0.247/0.468/0.443;Pi:0.000 24/0.000 56/0.000 44)，且各批次差異較大；QC第一批魚苗的遺傳多樣性(Hd:0.337/0.768/0.728/0.633;Pi:0.000 33/0.001 19 /0.000 98/0.000 76)明顯低于其他批次的遺傳多樣性；BAH放流群體遺傳多樣性低于苗種場平均水平。

2.5 草魚野生群體的歷史動態(tài)分析

一般來說，中性檢驗的數(shù)值為負且P值顯著則表示種群在其歷史上經(jīng)歷了擴張[19]。草魚野生群體的中性檢驗(表3)結(jié)果表明，PYH群體Tajima′s D與Fu′s Fs值都為負值，但P值均不顯著(P>0.05)；MD群體Tajima′s D值為負，但P值不顯著(P>0.05)。WZ群體Tajima′s D與 Fu′s Fs的檢驗結(jié)果均為負值，且P值均顯著(P<0.05)，說明WZ群體經(jīng)歷過種群的擴張。若將草魚野生群體作為一個整體來計算，其Tajima′s D值和Fu′s Fs值為負，且P值均顯著(P<0.05)，說明長江中上游草魚野生群體經(jīng)歷過種群的擴張。

表3 草魚野生群體中性檢驗

2.6 草魚群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

Arlequin軟件計算各群體的遺傳分化系數(shù)(表4)，野生群體(MD、WZ和PYH)和原種場親魚(QSS和QRC)間無遺傳分化存在(Fst在-0.030 30～0.061 44之間，P值均大于0.05)，但這5個群體與除LC、QC2、QC3外的苗種場群體間有顯著遺傳分化(P<0.05)，各苗種場群體兩兩間也大范圍地存在顯著遺傳分化(Fst在0.042 32～0.582 62之間，P值均小于0.05)。

表4 草魚群體間的遺傳分化系數(shù)

MEGA7軟件計算草魚各群體間遺傳距離(表5)，群體間遺傳距離最大的是WZ和HZ群體(0.001 914)，最小的是CD1和CD3群體間(0.000 360)。根據(jù)Nei′s[20]遺傳距離運用 UPGMA 法對草魚群體進行聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，苗種場群體中，CD、XS、YW以及SS人繁群體與其他群體之間遺傳距離較小，而YX和HZ群體與其他群體之間遺傳距離較大，各個野生群體與其他群體遺傳距離更大，尤其是WZ群體和其他群體之間。

表5 草魚群體間的遺傳距離

圖4 基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的草魚群體UPGMA樹

3 討論

物種的遺傳多樣性是其長期進化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進化的前提，物種遺傳多樣性越高，其對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強，反之種群適應(yīng)能力降低。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量物種遺傳多樣性的兩個重要指標[21]。Grant等[22]認為核苷酸多樣性指數(shù)低于0.005時，表明該群體的遺傳多樣性較低。根據(jù)本研究草魚野生群體以及養(yǎng)殖群體的核苷酸多樣性情況可知(表2)，無論是野生群體還是養(yǎng)殖群體，兩者的Pi都遠低于0.005，說明草魚各群體核苷酸多樣性處于較低水平，因此整體而言，長江中上游草魚的遺傳多樣性較低。

3.1 草魚野生群體的遺傳多樣性及歷史動態(tài)分析

野生群體中，WZ群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平高于MD和PYH群體。比較基于不同線粒體基因標記的草魚野生群體遺傳研究，發(fā)現(xiàn)本研究草魚野生群體遺傳多樣性水平與李樹華等[8]、朱秀芳[9]、翟東東等[10]、譚書貞等[23]以及傅建軍等[24]揭示的野生群體大致相當(dāng)，均處于較低水平，且近十年來未出現(xiàn)下降情況。

本研究Tajima′s D與 Fu′s Fs中性檢驗顯示只有WZ群達到顯著變化的水平，符合種群擴張的解釋，說明WZ草魚野生群體在歷史上經(jīng)歷了種群的擴張。這與傅建軍等[24]利用線粒體控制區(qū)序列分析草魚歷史動態(tài)的結(jié)果一致。

Grant等[22]研究結(jié)果表明，當(dāng)Hd≥0.5、Pi<0.005時，說明群體是受瓶頸效應(yīng)后迅速擴張導(dǎo)致。本研究野生草魚群體的單倍型多樣性都挺高(Hd>0.5)，但核苷酸多樣性較低(Pi<0.005)，說明野生草魚群體確實是遭受了瓶頸效應(yīng)之后迅速擴張而來。

3.2 草魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

養(yǎng)殖和野生群體因為受環(huán)境或者人為選擇壓力的影響，遺傳多樣性會存在一定差異。本研究顯示，草魚群體多樣性水平大小依次是，野生群體>原種場群體>苗種場群體>放流群體，野生群體多樣性水平要高于養(yǎng)殖群體，分析其原因，可能是長時間的單一親本繁殖、有效親本數(shù)量有限、遺傳漂變及相對封閉的養(yǎng)殖環(huán)境對養(yǎng)殖魚類的影響等引起養(yǎng)殖魚類遺傳多樣性下降。MD、WZ和PYH野生群體(Hd:0.769;Pi:0.001 43)、QSS和QRC原種場親魚群體(Hd:0.766;Pi:0.001 13)的遺傳多樣性水平相差不大，說明原種場養(yǎng)殖親魚是來源于野生江苗，多樣性水平未出現(xiàn)明顯變化。QSS和QRC原種場養(yǎng)殖親魚的遺傳多樣性均高于其人工養(yǎng)殖魚苗的多樣性，且存在原種場人工繁殖魚苗比部分普通苗種場如YX、HZ人工養(yǎng)殖魚苗遺傳多樣性水平還低的情況，說明原種場繁育親本缺乏科學(xué)的配對管理，沒有嚴格遵循管理要求進行篩選，從而導(dǎo)致人工養(yǎng)殖魚苗群體多樣性水平下降。

苗種場群體間的遺傳多樣性水平差異較大，如YX群體明顯比CD和XS等群體遺傳多樣性水平高，說明YX群體有效親本數(shù)量較多，種質(zhì)優(yōu)良，繁殖過程進行了較好的管理。同一苗種場多批次魚苗的多樣性水平也存在較大差異，比如QC1群體明顯比QC其他批次多樣性水平低，部分苗種場群體的多樣性水平明顯較低，尤其是CD三個群體、XS群體以及QC1群體，單倍型和核苷酸多樣性指數(shù)都很低(Hd<0.5;Pi<0.005)，這說明這些苗種場參與繁育親本少、出現(xiàn)了近親繁殖現(xiàn)象，遺傳多樣性水平有下降的趨勢，反映出部分養(yǎng)殖場并未按照苗種場相關(guān)規(guī)定進行嚴格的親本優(yōu)選配對、交換利用和苗種培育管理等?？傊绶N場大部分群體的多樣性水平都很低且明顯低于野生群體，一般認為，魚類人工養(yǎng)殖群體遺傳多樣性會有一定程度的下降，而導(dǎo)致魚類人工養(yǎng)殖群體遺傳變異性降低的主要因素是建立者效應(yīng)或遺傳漂變以及人工選擇[25]，這一點在其他魚類研究中也有報道，Taniguchi等[26]用微衛(wèi)星標記對香魚群體研究結(jié)果說明人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性確實會有一定程度的降低。

BAH放流群體遺傳多樣性水平低于野生、苗種場和原種場群體的遺傳多樣性水平，說明人工增殖放流時沒有使用遺傳多樣性水平高的群體，放流過程缺乏魚種質(zhì)量管控環(huán)節(jié)。

3.3 草魚群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

野生群體(MD、WZ和PYH)和原種場親魚(QSS和QRC)間無遺傳分化存在，但這5個群體與除LC、QC2、QC3外的苗種場群體間有顯著遺傳分化(P<0.05)，各苗種場群體兩兩間也大范圍地存在顯著遺傳分化(P<0.05)。野生地理群體間無分化，這與傅建軍[24]等研究長江水系木洞與萬州的結(jié)果相符，反映野生地理群體親本量巨大，繁育自由交配，基因交流廣泛，因此不存在遺傳分化現(xiàn)象。苗種場間以及與野生來源的群體間存在大范圍的顯著遺傳分化情況，說明苗種場在親本量貯存或者更新方面出現(xiàn)不足，且在人工干預(yù)情況下，苗種場之間缺乏交流。

群體間的遺傳距離能反映群體間的親緣關(guān)系，值越大親緣關(guān)系越疏遠。MEGA7軟件計算草魚各群體間遺傳距離(表5)，群體間遺傳距離在0.000 36～0.001 914之間，這明顯低于Shaklee等[27]提出的0.05、0.30、0.90作為魚類在種群、種以及屬的三級水平上的遺傳距離分界值，較小的遺傳距離說明草魚各群體間沒有產(chǎn)生明顯的分化。研究中草魚野生群體間的遺傳距離較小，顯示草魚地理群體間有很近的親緣關(guān)系，與遺傳分化研究結(jié)論對應(yīng)，也與朱葉[2]的結(jié)果相符。WZ群體與其他群體距離相對較大，養(yǎng)殖群體間的遺傳距離較小，中游養(yǎng)殖場群體多與PYH野生群體以及QSS和QRC原種場群體親緣關(guān)系近，這從某個角度上說明，長江中游的養(yǎng)殖親魚多來源于中游野生群體，較少來源于上游野生資源。

草魚35種單倍型中，單倍型Hap_1和Hap_2是各群體共享的主體單倍型，可以推斷其是較原始的、對外界環(huán)境適應(yīng)能力強的且能在草魚群體中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢單倍型。從單倍型發(fā)育樹來看，所有單倍型聚為一大支，表明群體的親緣關(guān)系較近，各群體沒有形成明顯的地理格局。mtDNA遵循嚴格的母系遺傳，一般不發(fā)生重組，后代能夠完整地保存母本遺傳信息，mtDNA一個單倍型即可代表一個母系集團[28]。根據(jù)本研究草魚線粒體DNA的Cytb序列單倍型數(shù)量，我們推測3個野生群體的雌性親魚數(shù)量至少有12尾，16個苗種場養(yǎng)殖群體至少有22尾。遺傳多樣性低的群體往往對應(yīng)的單倍型數(shù)量較少，如CD1和QC1群體的單倍型數(shù)量僅為2，表明這些養(yǎng)殖群體雌魚親本數(shù)量確實較少(表2)。

3.4 草魚種質(zhì)資源的保護建議

魚類在人工繁殖過程中遺傳多樣性降低，進而影響魚類生長、繁殖及適應(yīng)能力，這是魚類人工繁殖過程中出現(xiàn)“退化”現(xiàn)象的主要原因之一[29]。本研究中，草魚部分養(yǎng)殖群體遺傳多樣性顯著降低，說明養(yǎng)殖草魚已經(jīng)出現(xiàn)了種質(zhì)退化。此外，近年來長江水域因為污染、過度捕撈等原因，魚類棲息地喪失，草魚的野生資源量減少[10]；水電開發(fā)和江湖阻隔等使草魚群體出現(xiàn)隔離，部分地方如贛江等草魚群體棲息地出現(xiàn)片段化情況，這些都會降低草魚的遺傳多樣性，加速草魚的種質(zhì)衰退。因此，對于野生草魚資源，必須加強各水系草魚群體遺傳多樣性的系統(tǒng)研究和維護，進行原種資源的保存、管理和有序利用。對養(yǎng)殖草魚群體，須嚴格管理原種場、苗種場，保證草魚繁育親本的質(zhì)量和有效繁育群體足夠大，加強苗種培育管理，防止近交和混雜[1,11]。

致謝：

衷心感謝各原種場和苗種場等無私提供了實驗樣本，感謝中國科學(xué)院水生生物研究所魚類生態(tài)學(xué)與資源保護學(xué)科組各位老師和研究生們在采樣和數(shù)據(jù)分析上給予的幫助！