馮具攀，魏開金，徐 進(jìn)，于瑤瑤，徐 濱，馬寶珊，朱祥云

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，是我國目前養(yǎng)殖規(guī)模最大的淡水養(yǎng)殖蝦類，2019年養(yǎng)殖面積超過128萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)208.96萬t，經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值4 110億元[1]。在養(yǎng)殖和運(yùn)輸過程中，克氏原螯蝦會面臨著各種不同形式的應(yīng)激因子，如水溫、鹽度、溶氧、氨氮、pH值、亞硝酸鹽以及水體污染等[2]。其中以高溫應(yīng)激最常見、危害最大?？耸显r的最適生長溫度為21～28 ℃[3]，前期研究結(jié)果顯示，水溫超過30 ℃即可引起克氏原螯蝦機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，造成克氏原螯蝦生理機(jī)能紊亂[4]，導(dǎo)致其免疫力和抗病力顯著下降[5]。如何避免或緩解高溫應(yīng)激造成的不良影響，提高克氏原螯蝦的抗應(yīng)激能力，是目前亟需解決的問題。

谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine，glutathione，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時(shí)具有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽化合物，是一種天然的抗氧化劑，能增強(qiáng)動(dòng)物的免疫和抗氧化能力[6]。谷胱甘肽在自然界中以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種形式存在，主要活性成分是還原型谷胱甘肽，因此，通常所說的谷胱甘肽主要指的是還原型谷胱甘肽[7]。GSH在細(xì)胞內(nèi)是谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的特有底物，能促進(jìn)二者的合成而清除過氧化物和氧自由基，以維持細(xì)胞的正常生理功能[8]。GSH能否提高克氏原螯蝦的抗高溫應(yīng)激能力尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在評價(jià)GSH對克氏原螯蝦抗高溫應(yīng)激能力和生長的影響，為產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

克氏原螯蝦來自長江水產(chǎn)研究所梁子湖實(shí)驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)選擇健康、活力高、規(guī)格基本一致，初體重為(7.74±0.5) g的克氏原螯蝦。還原型谷胱甘肽購于上海源葉生物科技有限公司，含量99%。

1.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)分6個(gè)組，其中5個(gè)添加組和一個(gè)空白對照組，每組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組克氏原螯蝦30尾?？瞻讓φ战M投喂市售常規(guī)商品飼料(不含GSH)，添加組在商品飼料中分別添加0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg GSH。實(shí)驗(yàn)蝦暫養(yǎng)1周后開始養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，以蝦體重的5.0%投喂。每天在8:00～8:30、19:00～19:30各投喂1次，當(dāng)?shù)睾铀魉B(yǎng)殖，養(yǎng)殖期間24 h持續(xù)增氧，及時(shí)清污。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后，對每組實(shí)驗(yàn)蝦進(jìn)行稱重，計(jì)算平均體重增重率和飼料系數(shù)。

體重增重率=(實(shí)驗(yàn)?zāi)┪r體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)前蝦體質(zhì)量)/實(shí)驗(yàn)前蝦體質(zhì)量×100%

飼料系數(shù)=飼料消耗量/增重量

1.3 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)及樣本采集和測定

飼養(yǎng)6周后，開始高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。將各組實(shí)驗(yàn)蝦分別放入35 ℃水溫的實(shí)驗(yàn)盆中連續(xù)應(yīng)激48 h。應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)增氧，并減少人為干擾。在應(yīng)激前(0 h)及應(yīng)激后6、12、24、48 h，每個(gè)平行組隨機(jī)取3尾蝦采集血淋巴液，每個(gè)濃度組9個(gè)樣本。將蝦迅速撈起并立即用1 mL注射器在圍心腔采取血淋巴，采用等體積的肝素鈉溶液(0.02 g/mL)抗凝。血淋巴液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液于-80 ℃保存待用。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH-T)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件單因素方差分析(one way ANOVA)和DUNCAN多重比較[9]，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴抗氧化指標(biāo)的影響

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測結(jié)果顯示(表1)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中GSH-T含量無顯著差異。0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激6 h后血淋巴中的GSH-T含量比對照組顯著增加，0.24 g/kg濃度組在應(yīng)激12 h后血淋巴中的GSH-T含量比對照組顯著增加，而低于此添加濃度，GSH對GSH-T的影響不明顯。添加組血淋巴中GSH-T含量在應(yīng)激后至24 h呈現(xiàn)出增加的趨勢，并在24 h大幅提升到最大值，隨后降低，趨于穩(wěn)定。

表1 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴中GSH-T的影響

總抗氧化能力的檢測結(jié)果顯示(表2)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中T-AOC水平無顯著性差異。0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激6 h后血淋巴中的T-AOC含量比對照組顯著增加，0.24 g/kg濃度組在應(yīng)激12 h后血淋巴中的T-AOC含量比對照組顯著增加，而低于此添加濃度，GSH對T-AOC的影響不明顯。添加組血淋巴中T-AOC含量在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，應(yīng)激后12 h達(dá)到最高值。

表2 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴中總抗氧化能力的影響

總超氧化物歧化酶的檢測結(jié)果顯示(表3)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中的T-SOD水平無顯著性差異。與對照組相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激后6 h，T-SOD水平顯著升高；0.18 g/kg濃度組在應(yīng)激后24 h，T-SOD水平顯著升高；而0.06 g/kg和0.12 g/kg添加組在應(yīng)激后血淋巴中的T-SOD水平與對照組無顯著性差異。添加組血淋巴中T-SOD水平在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，應(yīng)激后6 h達(dá)到峰值，12 h后降至低于應(yīng)激前水平。

表3 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴中總超氧化物歧化酶的影響

過氧化氫酶的測定結(jié)果顯示(表4)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中的CAT含量無顯著性差異。與對照組相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激后6 h，CAT水平顯著升高；而低于0.24 g/kg的添加組應(yīng)激后血淋巴中的CAT水平與對照組無顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組血淋巴中CAT水平在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，應(yīng)激后12 h達(dá)到峰值，隨后回落至應(yīng)激前水平。

表4 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴中過氧化氫酶的影響

丙二醛的測定結(jié)果顯示(表5)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中的MDA含量無顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中MDA含量在應(yīng)激后呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在應(yīng)激后12 h達(dá)到最大值，而后逐漸降低，趨于穩(wěn)定。0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組MDA含量在應(yīng)激后12 h均比對照組顯著降低，0.12 g/kg和0.18 g/kg濃度組MDA含量在應(yīng)激后24 h均比對照組顯著降低，48 h后差異不顯著。

表5 谷胱甘肽對克氏原螯蝦血淋巴中丙二醛的影響

2.2 谷胱甘肽對克氏原螯蝦生長的影響

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對各組實(shí)驗(yàn)蝦的體重進(jìn)行測定。結(jié)果顯示(表6)，除了0.06 g/kg添加組的實(shí)驗(yàn)蝦的增重率與對照組無顯著性差異外，其它添加組均比對照組有顯著性提升；0.18、0.24、0.30 g/kg添加組的飼料系數(shù)比對照組顯著降低。其中0.30 g/kg添加組的增重率最高，飼料系數(shù)最低。

表6 谷胱甘肽對克氏原螯蝦生長的影響

3 討論

3.1 谷胱甘肽對克氏原螯蝦抗氧化能力的影響

動(dòng)物應(yīng)激會產(chǎn)生超量的活性氧自由基，從而引發(fā)機(jī)體內(nèi)部的新陳代謝失調(diào)，使動(dòng)物的健康和營養(yǎng)狀態(tài)受到很大影響。動(dòng)物體內(nèi)存在著抗氧化物酶，如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，可以清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，并且這些抗氧化酶活性的提高也有助于緩解多不飽和脂肪酸氧化、亞硝酸鹽應(yīng)激、饑餓、溫度變化產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[10]。本實(shí)驗(yàn)投喂谷胱甘肽能顯著提高克氏原螯蝦血淋巴中各抗氧化酶的水平，表明機(jī)體的抗氧化能力得到增強(qiáng)。MDA是膜脂過氧化的最重要產(chǎn)物之一，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，因而具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，會對機(jī)體造成損害[11,12]。因此，檢測MDA的含量能了解膜脂的過氧化程度，評估氧化應(yīng)激的危害程度。本實(shí)驗(yàn)中投喂谷胱甘肽能顯著降低克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激時(shí)血淋巴中的MDA含量，表明谷胱甘肽能有效提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，降低高溫應(yīng)激造成的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它水產(chǎn)動(dòng)物的研究結(jié)果一致。研究資料顯示，飼料中添加適量谷胱甘肽可顯著提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)肝臟谷胱甘肽水平、谷胱甘肽過氧化物酶活力和超氧化物歧化酶活力，顯著增強(qiáng)草魚的抗氧化能力、非特異性免疫力以及生長性能[13-16]。在吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)上的研究顯示，飼料添加0.24g/kg谷胱甘肽可顯著提高吉富羅非魚肝臟谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活力、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力和過氧化氫酶活力，并且顯著降低丙二醛含量[17]。谷胱甘肽能顯著提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[18]、皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)[19]肝胰腺中抗氧化酶活力以及總抗氧化能力。

3.2 谷胱甘肽對克氏原螯蝦生長的影響

已有許多研究表明，谷胱甘肽對水產(chǎn)動(dòng)物生長具有促進(jìn)作用。周艷玲[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中谷胱甘肽添加量的增加，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的增重率會呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，生長指標(biāo)在添加量為0.30 g/kg時(shí)達(dá)到最大值，且添加組均顯著高于對照組。飼料中添加適量谷胱甘肽可使草魚的特定生長率和存活率顯著提高并且降低飼料系數(shù)，添加量為300 mg/kg時(shí)特定生長率最高,比對照組提高10.08%[15]。劉曉華等[21]研究表明，在凡納濱對蝦基礎(chǔ)日糧中添加適量谷胱甘肽，能夠顯著提高其增重率和飼料轉(zhuǎn)化效率，并且各添加組的成活率均顯著高于對照組。當(dāng)飼料中谷胱甘肽添加量為0.18 g/kg時(shí)增重率達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了添加量大于0.18 g/kg的谷胱甘肽能顯著提高克氏原螯蝦的增長率，降低餌料系數(shù)。對于谷胱甘肽的促生長機(jī)制，已有研究表明，谷胱甘肽能上調(diào)類胰島素生長因子Ⅰ和生長激素基因的表達(dá),增加生長激素、甲狀腺激素和類胰島素生長因子I的分泌，促進(jìn)羅非魚的生長[17,22,23]。除了促進(jìn)生長激素的分泌，我們推測谷胱甘肽的促生長作用也跟其抗應(yīng)激作用相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激時(shí)，機(jī)體會大量消耗葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪來應(yīng)對和消除應(yīng)激的不良影響[3]，而谷胱甘肽能有效降低機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，減少了上述營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，間接促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)的積累和體重的增加。谷胱甘肽的促生長機(jī)制，還需從物質(zhì)能量代謝的角度做進(jìn)一步研究和探討。